擬蜘蛛牽絲蛋白基因在大腸桿菌和小鼠乳腺表達研究.pdf

1、蜘蛛牽絲是目前已知的最為堅韌的天然纖維之一.它具有優(yōu)異的機械特性,其超強的強度和出色的彈性是其它天然和人工材料所無法比擬的.它的強度非常高,同等重量的蜘蛛牽絲強度是鋼的五倍.蜘蛛牽絲優(yōu)異的機械特性使它在軍工、醫(yī)療、建材和紡織等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景.該研究側(cè)重于獲得便于操作且高效表達的蜘蛛牽絲蛋白基因結(jié)構(gòu),繼而開展大規(guī)模生產(chǎn)擬蜘蛛牽絲蛋白.依據(jù)已報道的蜘蛛牽絲蛋白部分cDNA序列,設(shè)計合成了兩種不同結(jié)構(gòu)的擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體,大小分別

2、為360bp和390bp.多聚化分別得到2聚體、4聚體、6聚體、8聚體和16聚體.依據(jù)已報道的蜘蛛牽絲蛋白序列設(shè)計合成一段大小為19個氨基酸的短肽.將此短肽與載體蛋白匙孔血藍蛋白(KLH)偶聯(lián),免疫新西蘭大耳白兔,獲得抗蜘蛛牽絲蛋白血清.將得到的兩種結(jié)構(gòu)8聚體和16聚體與表達載體pET-30a連接,獲得四種表達載體pET30a-X8、pET30a-X16、pET30a-F8和pET30a-F16.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),用IPT

3、G誘導(dǎo)表達.用制備的抗蜘蛛牽絲蛋白血清做Westernblot檢測到有蜘蛛牽絲蛋白的表達.表達產(chǎn)物呈梯度排列,主帶分別在85KD、165KD、85KD和165KD,與預(yù)計大小基本一致.表達量分別為800mg/L、500mg/L、200mg/L和200mg/L左右.根據(jù)山羊β-酪蛋白信號肽我們設(shè)計了一段長125bp的DNA序列.將此DNA序列分別與兩種擬蜘蛛牽絲蛋白基因結(jié)構(gòu)4聚體和6聚體連接后,插入乳腺特異表達載體pBC1,最后得到四種乳

4、腺表達載體pBC1-F4,pBC1-X4,pBC1-F6和pBC1-X6.將pBC1-F4和pBC1-X6兩種表達載體用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠.對于pBC1-X6,共獲得58只小鼠,用PCR和Southern雜交的方法檢測出10只為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠,包括5只母鼠和5只公鼠,轉(zhuǎn)基因陽性率約為17﹪.經(jīng)PCR檢測,大部分原代鼠的F1代都可以檢測到擬蜘蛛牽絲蛋白基因陽性小鼠.經(jīng)Western blot檢測,在5只陽性原代母鼠和8只F1母鼠的乳

5、汁中,有2只原代母鼠和7只F1母鼠可以檢測到擬蜘蛛牽絲蛋白的表達.除了有預(yù)計大小蛋白表達外,還有部分小鼠表達與預(yù)計大小不一致的產(chǎn)物.用放免方法檢測表達量在11-50mg/L.對于pBC1-F4,共出生59只小鼠,用PCR和Southern雜交的方法檢測7只為轉(zhuǎn)基因小鼠,包括3只母鼠和4只公鼠,基因整合率為12﹪.所有原代鼠的F1代都可以檢測到擬蜘蛛牽絲蛋白基因陽性小鼠.經(jīng)Western blot檢測,在3陽性原代母鼠和6只F1母鼠的乳汁