N6-甲基嘌呤(m6A)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14對胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 N6-甲基嘌呤(m6A)在胰腺癌細(xì)胞系及組織中表達(dá)水平的檢測
　　目的：檢測m6A在胰腺癌癌組織及癌旁組織中的含量，比較胰腺癌癌組織和癌旁組織中mA6表達(dá)豐度的差異。
　　方法：采用比色法定量檢測了21例胰腺癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織，6種胰腺癌細(xì)胞系和8例正常胰腺組織中m6A的在總RNA中的表達(dá)水平，分析m6A在胰腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)差異。采用液相色譜法定量檢測了21胰腺

2、癌癌組織及相應(yīng)癌旁組織，7種胰腺癌細(xì)胞系和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中m6A的在mRNA中的表達(dá)水平，分析m6A在胰腺癌組織和癌旁組織的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：與正常胰腺組織和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，胰腺癌癌組織和細(xì)胞系中的m6A是高表達(dá)的。
　　結(jié)論：m6A在胰腺癌中表達(dá)豐度是增加的
　　第二部分 N6-甲基嘌呤(m6A)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14在胰腺癌組織中的表達(dá)與預(yù)后
　　目的：檢測METTL14在120例胰腺

3、癌病人在胰腺癌中的表達(dá)，并結(jié)合病人的臨床資料，研究 METTL14在胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異，探討METTL14表達(dá)水平與患者臨床資料的相關(guān)性。
　　方法：檢測METTL14在120例胰腺癌患者的在癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平，并結(jié)合病人的臨床資料，分析METTL14的表達(dá)量與胰腺癌病人臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。然后，采用real-time PCR和western blot的方法對我院膽胰外科20

4、例胰腺癌組織標(biāo)本進一步檢測和確認(rèn)METTL14的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1.與癌旁組織相比較，METTL14在胰腺癌組織中主要呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。結(jié)合臨床病理資料分析顯示，METTL14的表達(dá)與胰腺癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）。結(jié)合隨訪資料的生存分析顯示，METTL14的高表達(dá)與胰腺癌病人的預(yù)后較差（P<0.05）。
　　2.胰腺癌組織中METTL14基因水平較相應(yīng)癌旁組織增加。
　

5、　3.胰腺癌組織中METTL14蛋白水平較相應(yīng)癌旁組織增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：METTL14在胰腺癌組織多呈高表達(dá)，高表達(dá)的METTL14胰腺癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且提示胰腺癌病人較差的預(yù)后。
　　第三部分 METTL14對胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)外研究
　　目的：本部分使用3種胰腺癌細(xì)胞系作為工具，通過構(gòu)建METTL14下調(diào)或過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，研究METTL14干預(yù)對胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的

6、影響。
　　方法：利用慢病毒載體has-METTL14-SH-flag和has-METTL14-flag轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞Panc-1、Mia和Bxpc-3后，構(gòu)建METTL14下調(diào)干預(yù)或上調(diào)干預(yù)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。檢測METTL14干預(yù)后m6A的變化。通過CCK8、平板克隆實驗、transwell和劃痕實驗，分析METTL14干預(yù)后胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。使用上調(diào)和下調(diào)METTL14的穩(wěn)轉(zhuǎn)PANC-1細(xì)胞系，構(gòu)建裸鼠皮下

7、成瘤模型和裸鼠胰腺癌細(xì)胞脾臟包膜注射肝轉(zhuǎn)移模型，評價METTL14干預(yù)后胰腺癌細(xì)胞系在裸鼠體內(nèi)成瘤能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的差異。
　　結(jié)果：1.甲基化酶METTL14可以調(diào)控胰腺癌細(xì)胞中m6A水平的變化。
　　2.在3種胰腺癌細(xì)胞系中下調(diào)METTL14，可以顯著降低胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　3.在胰腺癌細(xì)胞系中上調(diào)METTL14，可以顯著增加胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的能力。
　　4.裸鼠皮下成瘤模型中

8、，下調(diào) METTL14表達(dá)可以減少皮下成瘤的體積，上調(diào)METTL14表達(dá)可以增加皮下成瘤的體積相對于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.上調(diào)METTL14的表達(dá)，可以促進裸鼠脾包膜注射肝轉(zhuǎn)移模型中肝臟微轉(zhuǎn)移灶的形成，下調(diào)METTL14的表達(dá)，可以抑制裸鼠脾包膜注射肝轉(zhuǎn)移模型中肝臟微轉(zhuǎn)移灶的形成。和對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：METTL14可以調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的m6A的變化，METTL14促進胰腺癌細(xì)胞的增殖

9、和侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第四部分 METTL14促進胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制研究
　　目的：研究METTL14通過作用于哪條可能的信號通路調(diào)控胰腺癌的惡性生物學(xué)行為。
　　方法：利用二代測序技術(shù)篩選METTL14敲減干預(yù)后發(fā)生變化的信號通路及差異的miR表達(dá)譜，再結(jié)合生物信息學(xué)的方法，預(yù)測調(diào)控信號通路的microRNA，篩選出METTL14調(diào)控的信號通路所依賴的microRNA。
　　結(jié)果：1. METTL14對