肺炎鏈球菌Gts、PotD及SrtA蛋白聯(lián)合免疫對(duì)其感染的保護(hù)作用及肺炎鏈球菌外膜蛋白SPD1741和SPD0280的初步晶體學(xué)研究.pdf

1、目的：肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是人類(lèi)主要致病菌，在臨床上廣泛引起中耳炎、敗血癥、腦膜炎及致死性肺炎等多種疾病。全球每年大約有160萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌引起的各種疾患。盡管抗生素治療是控制肺炎鏈球菌感染的有效手段，但并不能有效降低肺炎鏈球菌感染最初48小時(shí)的死亡率。隨著抗生素的濫用，臨床上耐藥菌株明顯增加。因此，通過(guò)接種肺炎鏈球菌疫苗以預(yù)防其感染成為積極有效的手段。
　　新一代的蛋白疫苗

2、是預(yù)防肺炎鏈球菌感染的未來(lái)發(fā)展方向，但目前國(guó)際上對(duì)蛋白質(zhì)疫苗尚處于臨床前研究階段，由于單一蛋白的保護(hù)效果并不理想，聯(lián)合蛋白疫苗是目前研究的熱點(diǎn)。采用多種肺炎鏈球菌毒力蛋白聯(lián)合免疫，以擴(kuò)大其對(duì)機(jī)體的保護(hù)效應(yīng)是一種可行方式，因?yàn)榈鞍卓乖?lián)合疫苗提供了多種毒力作用的潛在靶標(biāo)。
　　Gts、PotD和SrtA蛋白都是肺炎鏈球菌的重要毒力因子，生物信息學(xué)分析顯示其在肺炎鏈球菌中保守性高，且均在細(xì)菌表面有表達(dá)，但尚未有報(bào)道對(duì)其作為疫苗候選蛋白

3、進(jìn)行系統(tǒng)的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)。本研究擬先比較肺炎鏈球菌Gts、PotD和SrtA單個(gè)蛋白抗原免疫小鼠后，對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)作用；然后采用不同血清型的肺炎鏈球菌，檢測(cè)上述蛋白兩兩聯(lián)合、三種蛋白組合后免疫小鼠，與單個(gè)蛋白抗原組比較，以評(píng)價(jià)其對(duì)肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果。
　　方法：本研究首先通過(guò)基因克隆、蛋白表達(dá)及純化技術(shù)，成功制備了肺炎鏈球菌Gts、PotD及SrtA重組蛋白。重組蛋白經(jīng)鼻腔免疫途徑，以研究抗原特異性反應(yīng)，并檢測(cè)其體

4、液和細(xì)胞調(diào)節(jié)反應(yīng)。為了模擬肺炎鏈球菌感染的自然途徑，以評(píng)價(jià)Gts、PotD及SrtA重組蛋白抗原對(duì)小鼠鼻腔感染后的保護(hù)效果，選擇肺炎鏈球菌中致病能力最強(qiáng)的D39菌株進(jìn)行鼻腔攻毒實(shí)驗(yàn)，以構(gòu)建肺炎鏈球菌性肺炎的小鼠模型。為了更充分地評(píng)估Gts、PotD和SrtA重組蛋白不同組合對(duì)多種血清型肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果，本研究采用上述重組蛋白抗原經(jīng)小鼠腹腔免疫，然后選擇不同血清型肺炎鏈球菌進(jìn)行腹腔攻毒實(shí)驗(yàn)研究。再次采用特異性抗血清免疫小鼠后，選擇

5、D39肺炎鏈球菌進(jìn)行鼻腔攻毒實(shí)驗(yàn)，以鑒定重組蛋白抗原的保護(hù)性是否由其特異性抗體介導(dǎo)的。采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)，以分析Gts、PotD和SrtA重組蛋白及其特異性抗血清對(duì)D39細(xì)胞粘附于A549細(xì)胞的影響；最后，為了進(jìn)一步探討人體經(jīng)肺炎鏈球菌感染后，該細(xì)菌表面抗原Gts、PotD和SrtA刺激機(jī)體產(chǎn)生的天然抗體滴度變化，本研究收集正常人群及急性肺炎患者，擬采用ELISA法測(cè)定血清中anti-Gts、anti-PotD及anti-SrtA抗血清的

6、滴度變化。
　　結(jié)果：在成功克隆和表達(dá)Gts、PotD和SrtA重組蛋白基礎(chǔ)上，通過(guò)Western blot分析證實(shí)，CMCC(B)31216(serotype9V)、CMCC(B)31436(serotype3)、CMCC(B)31507(serotype7F)等8種血清型的肺炎鏈球菌均能表達(dá)Gts、PotD和SrtA蛋白，且蛋白抗原性未發(fā)生變異。粘附抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單一Gts、PotD和SrtA蛋白都能抑制D39對(duì)A549細(xì)胞的

7、粘附，且2-3個(gè)蛋白質(zhì)抗原的聯(lián)合使用，具有明顯的累加效應(yīng)。此外，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清的單獨(dú)使用或2-3個(gè)抗血清的聯(lián)合使用，也具有和蛋白抗原類(lèi)似的抑制效應(yīng)。通過(guò)鼻腔滴注Gts、PotD或SrtA重組蛋白，小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的Th1介導(dǎo)的細(xì)胞因子IFN-γ、Th2介導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-4、Treg介導(dǎo)的IL-10因子和Th17介導(dǎo)的細(xì)胞因子IL-17A，誘導(dǎo)了小鼠對(duì)肺炎鏈球菌的粘膜免疫及系統(tǒng)免疫。在構(gòu)建的肺炎球菌感

8、染的小鼠模型中，Gts、PotD或SrtA重組蛋白重組通過(guò)粘膜途徑免疫小鼠，均能有效減少19F型肺炎鏈球菌在鼻咽部及肺部的定植。與單個(gè)蛋白抗原比較，Gts+SrtA、PotD+Gts+SrtA均能顯著提高肺炎鏈球菌對(duì)肺部定植的保護(hù)作用。3個(gè)蛋白抗原聯(lián)合粘膜免疫后，對(duì)肺炎鏈球菌中致病能力最強(qiáng)的D39血清型鼻腔感染保護(hù)率可達(dá)83.3％。
　　腹腔免疫結(jié)果與粘膜免疫類(lèi)似，幾乎所有蛋白抗原聯(lián)合都較單個(gè)蛋白的保護(hù)作用更強(qiáng)。但與蛋白兩兩組合比

9、較，Gts+PotD+SrtA的三聯(lián)蛋白抗原的聯(lián)合腹腔免疫，其保護(hù)作用并未見(jiàn)明顯加強(qiáng)。被動(dòng)免疫研究提示，抗-Gts、抗-PotD和抗-SrtA抗血清聯(lián)合免疫小鼠，其對(duì)小鼠腹腔感染肺炎鏈球菌的保護(hù)作用與主動(dòng)免疫的效果相似，提示Gts、PotD及SrtA蛋白抗原通過(guò)主動(dòng)免疫激發(fā)的保護(hù)效應(yīng)與其抗體的作用密切相關(guān)。
　　結(jié)論：通過(guò)本研究的分析顯示，Gts、PotD及SrtA在肺炎鏈球菌中的保守性高，三種蛋白聯(lián)合抗原的兩兩組合及三種聯(lián)合，通