條斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因（PyTPS）的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及與其它藻類(lèi)TPS基因的比較遺傳學(xué)研究.pdf

1、海藻糖是一種廣泛存在于自然界中的非還原性雙糖。研究表明它與生物體抗干旱、鹽堿、低溫等逆境的能力有關(guān)；將大腸桿菌和擬南芥的海藻糖合成酶基因?qū)胫参?，可以提高植物抗干旱、抗鹽堿的能力。但對(duì)生活于海邊潮間帶、具有高度抗鹽、抗旱能力的海藻的海藻糖合成酶基因(TPS)的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化迄今尚未見(jiàn)任何報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)室從條斑紫菜中克隆了海藻糖合成酶基因(PyTPS)，獲得了其核DNA和cDNA序列，二者都為2727bp，沒(méi)有內(nèi)含子。將對(duì)應(yīng)的蛋白

2、質(zhì)序列與其它物種的聚類(lèi)分析得知，PyTPS與水稻TPS(OsTPs，Accession No．XP_475716)和擬南芥TPS(AtTPS5，Accession No．．NP_567538)的同源關(guān)系最近(約40％)。構(gòu)建了PyTPS基因原核表達(dá)載體pET22b-PyTPS并將其在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)；構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcAMBIA2300-PyTPS并將其通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻品種TP309，經(jīng)過(guò)抗生素篩選和PCR檢測(cè)后

3、，得到201個(gè)T0代轉(zhuǎn)基因植株系。經(jīng)擴(kuò)繁、篩選、鑒定，得到131個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)過(guò)8‰的NaCl鹽溶液篩選和分子檢測(cè)后，共得到78株陽(yáng)性的植株，分別來(lái)自27個(gè)株系。經(jīng)進(jìn)一步擴(kuò)繁、篩選、鑒定，得到三個(gè)較純合的T2代轉(zhuǎn)基因株系；其PCR檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)都呈陽(yáng)性，表明PyTPS基因已整合到這些轉(zhuǎn)基因株系中。對(duì)它們的抗鹽性測(cè)定表明，它們的抗鹽性較對(duì)照有明顯提高。 隨后，利用同源克隆的方法從來(lái)自紅藻、褐藻及綠藻的七種海

4、藻(海帶、壇紫菜、龍須菜、角叉菜、礁膜、滸苔、孔石莼)的基因組DNA中克隆了它們的TPS基因，它們DNA序列與條斑紫菜的大小完全一樣，均為2727bp。用DNAMAN軟件進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)這八種海藻的TPS基因DNA序列的一致性高于94％；而它們氨基酸序列的一致性高于97％，推測(cè)它們的功能可能也是相似的。將推導(dǎo)出的各自的氨基酸序列提交到PSIPRED蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)除了壇紫菜以外，其它七種海藻的TPS二級(jí)結(jié)構(gòu)間

5、差異很小。選取海帶的TPS基因(LjTPS)，也構(gòu)建了其原核表達(dá)載體pET22b-LjTPS，發(fā)現(xiàn)它在大腸桿菌BL21中表達(dá)出的蛋白的大小與pET22b-PyTPS表達(dá)出的蛋白大小一樣． 將獲得的八種海藻的TPS與其它物種的TPS進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)與其它物種間的一致性較低，其中一致性最高的是水稻和擬南芥，他們與海藻TSP氨基酸序列的一致性達(dá)到40％，一致性次之的是酵母的TSP，他們的一致性只有27％左右；最低的是與大腸