FLP-frt重組系統的構建和在轉基因煙草中的應用.pdf

1、以轉基因技術為代表的植物基因工程技術為農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了強有力的支持，但是用以有效篩選轉基因植物的選擇標記基因(如抗生素抗性基因、除草劑抗性基因等)的使用卻引發(fā)了人們對轉基因植物安全性的隱憂。因此，培育具有安全選擇標記基因或無選擇標記基因的轉基因植物成為提高轉基因植物安全性的有效手段。其策略之一是在轉化植株篩選完成后，采取一系列措施將選擇標記基因刪除。來自于啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2μm質粒的FLP

2、/frt位點特異性重組系統中重組酶FLP可催化位于同一分子上兩個同向frt位點間DNA片段的切除，利用該系統可實現篩選完成后選擇標記基因的刪除。 本工作構建出可有效去除轉基因植物中選擇標記基因的FLP/frt位點特異性重組系統：含有FLP重組酶基因的植物表達載體pCAMBIA1300-35S-FLP-hpt和含有frt位點的植物表達載體pCAMBIA1300-AtNHX1-frt-als-frt和pCAMBIA1300-betA

3、-frt-als-frt。組成型啟動子CaMV35S調控的重組酶FLP基因的表達可催化位于選擇標記基因als兩側同向frt位點間的重組反應從而有效去除選擇標記基因als。為了提高該系統在轉基因植物中的重組效率，在FLP重組酶基因編碼區(qū)前添加了植物最適翻譯修飾序列AACA，在含有frt位點的植物表達載體中位于選擇標記基因als一側的是一個全長的frt位點，而另一側為僅包含核心重組序列的截短的frt位點。 利用共轉化和二次轉化的方式

4、將含育frt位點的植物表達載體pCAMBIA1300-AtNHX1-frt-als-frt或pCAMBIA1300-betA-frt-als-frt和含有FLP重組酶基因的植物表達載體pCAMBIA1300-35S-FLP-hpt同時或先后轉入煙草植株驗證FLP/frt位點特異性重組系統在轉基因植物中的重組功能。實驗結果表明：利用重組酶FLP植物表達載體二次轉化含有frt位點的抗選擇標記煙草植株時，17％的共轉化植株發(fā)生了選擇標記基因切

5、除事件；利用含有frt位點的植物表達載體與重組酶FLP植物表達載體共轉化煙草時，二者感染煙草葉盤濃度比為3∶1時共轉化效率最高，為21％，共轉化植株選擇標記基因的切除效率為5％；而利用含有frt位點的植物表達載體二次轉化含有重組酶FLP基因的轉基因煙草植株時，轉化效率只有1.6％，且未見到選擇標記基因被切除。 利用誘導型啟動子誘導FLP重組酶基因在植物發(fā)育的特定時期高效表達可防止FLP重組酶基因在轉基因植物中組成型表達帶來的基因

6、組不穩(wěn)定等問題。相對于其它誘導型啟動子，熱誘導啟動子具有誘導簡便、反應靈敏、作用高效、對植物生長發(fā)育危害小等優(yōu)點。本工作克隆得到黑豆和黃豆“荷豆2號”熱誘導蛋白啟動子hsp1和hsp2，序列分析表明二者均具備高等植物啟動子的必需元件和熱誘導元件。對轉基因煙草中gus基因表達產物β-葡萄糖醛酸酶活性的組織化學染色和熒光定量分析表明，大豆熱誘導蛋白啟動子hsp1和hsp2均可經間隔12小時的兩次42℃下2小時的熱激處理誘導目的基因的表達，熱