小鼠第一極體(PB1)重組卵母細胞去精核孤雌發(fā)育研究.pdf

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠第一極體（PB1）重組卵母細胞去精核孤雌發(fā)育研究姓名：王建華申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：細胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：李躍民20090501兩南大學(xué)碩十等：何論文曼曼皇曼!!曼!皇曼曼!曼!!曼曼曼曼曼曼!曼!曼曼曼曼烹!!!!曼!!苧苧!!蔓曼曼鼉曼皇曼!皇苧!!曼曼烹皇曼曼!曼曼苧!曼曼舅鼉曼曼曼鼉皇堂nnn鼉曼曼本研究根據(jù)以上設(shè)計，首先對人為可控PBl排出的確切時間段和批量獲取高活性PBl的簡易方法進行了研究；通過卵母細

2、胞的去核、移入極體和體外受精等方法觀察PBl移入后形成雌原核的情況和受精卵裂發(fā)育情況；在此基礎(chǔ)上將PBl移入成熟的沒有去核的卵母細胞后，進行體外受精，在雌雄原核形成后去除雄原核，研究觀察含有PBI雜合二倍染色體卵母細胞的孤雌發(fā)育和胚胎卵裂情況。本研究集核移植技術(shù)、體外受精技術(shù)、卵母細胞成熟培養(yǎng)技術(shù)、孤雌激活和核型分析技術(shù)等多種胚胎工程上游技術(shù)于一體，研究探索了含有PBl新型雜合二倍體孤雌胚胎的牛成途徑和影響提高其生成效率的因素。試驗總結(jié)

3、如下：1人工控制PBl排出時間研究本試驗用孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)對68周齡的雌性昆明系小鼠進行超數(shù)排卵處理。從注射hCG后10h開始每隔1h取一組小鼠(每組3只小鼠)，從輸卵管內(nèi)收集卵母細胞卵丘細胞復(fù)合體(COCs)，用適當(dāng)濃度的透明質(zhì)酸酶處理，脫去卵丘細胞，觀察卵母細胞的數(shù)量乖]PBl形態(tài)，并根據(jù)本實驗自制的一套極體分級圖(見圖31)進行分級，以確定剛剛排出PBl卵母細胞的最佳采集時間。結(jié)果表明：在相同的超

4、排處理過程中，注射hCG后12h、13h茅D14h得到的l、II級PBl率較高，其中12h最高(6087％)，且三者之間差異不顯著(PO05)，12h與11h和14h以后其他各組相比均差異顯著(PO，05)。結(jié)果顯示：hCG注射后12h所收集到的含PBl的卵母細胞，為剛剛排出極體從卵巢排出進入輸卵管的新鮮卵母細胞，在進行極體重組實驗時應(yīng)選擇此時的卵母細胞和卵母細胞中的PBl為試驗材料。2囪‘效收集高活性PBl的研究本試驗采用不同濃度的鏈

5、蛋白酶(15％、1％、05％)于不同作用時間對含有PBl的卵母細胞進行去除透明帶處理，對分離出來的PBl采用臺盼藍染色，以篩選出適合本試驗條件去除透明帶分離出高活性PBl的有效方法。試驗結(jié)果表明：處理組3(1％，5min)所獲得的高活性PBl率均高于其他各處理組，達到了8000％，且與其他處理組差異顯著(P005)；其他各組除了處理組2(05％，8min)和處理組5(15％，5min)差異不顯著外差異均顯著(PO05)。因此在進行以PB