基于高通量測序和代謝組學的艱難梭菌感染患者腸道微生態(tài)研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 綜合性醫(yī)院艱難梭菌感染流行病學特征及危險因素分析
　　艱難梭菌是一種嚴格厭氧、革蘭陽性芽孢桿菌，屬于條件致病菌。在長期大量應用抗生素或者人體免疫力低下、腸道菌群紊亂的情況下艱難梭菌會過度增殖并釋放毒素，引起以腸道病理損傷為主的感染性疾病，即艱難梭菌感染(Clostridium difficile Infection，CDI)。在西方發(fā)達國家，艱難梭菌已超過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

2、成為院內相關性感染的首要病原菌。高達20％-30％的抗生素相關性腹瀉和近乎所有的偽膜性腸炎與之相關。近年來，隨著艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAPⅠ/027型)的出現，該病的嚴重病例數、復發(fā)率和病死率均明顯增高。鑒于中國人口眾多，抗生素廣泛使用及人口老齡化的形勢，CDI極有可能成為威脅公共健康的流行性疾病之一，應加強艱難梭菌感染監(jiān)測。
　　本研究一方面對我國一家綜合性醫(yī)院腹瀉患者進行艱難梭菌分離鑒定、毒素分類及MLST分型研究，從來

3、自不同科室的1845例腹瀉患者糞便中分離出產毒艱難梭菌161株;科室間產毒艱難梭菌的分離率存在差異，ICU和老年病科的分離率較高;艱難梭菌A+B+型檢出率為83.2％(134/161)，A-B+型檢出率為16.8％(27/161)，二元毒素檢出率僅為1.9％(3/161);161株產毒艱難梭菌共分出31個ST型，其中ST-220是本研究新發(fā)現的ST型，ST-54、ST-35和ST-37為本研究菌株中的優(yōu)勢型別，ST-54型為23.0％(

4、37/161)， ST-35型為19.3％(31/161)，ST-37型為10.0％(16/161)，未檢測到高產毒株ST-1（027型）和ST-11(078型);不同的ST型別與毒素基因之間、科室間存在相關性，ST-37型的菌株均為A-B+，占本研究中A-B+菌株的59.3％(16/27)，ST-54是老年病科、感染病科和血液病科的優(yōu)勢型別，但無證據提示研究期間院內發(fā)生CDI暴發(fā)流行。
　　同時，我們還評估了CDI高危人群血液病

5、科患者艱難梭菌的感染率，并結合病人的住院診療過程，進行了危險因素分析?；熃M和造血干細胞移植組分別分離到產毒艱難梭菌21株和14株，計算得到CDI累積發(fā)病率分別為1.89/1000和3.69/1000住院日;依托泊苷、氟喹諾酮類藥物的使用與CDI發(fā)生相關;35株艱難梭菌共分出13個ST型，ST-54和ST-3為本研究菌株中的優(yōu)勢型別，未檢測到高產毒株ST-1（027型）和ST-11（078型）。近80％的CDI發(fā)生于患者造血干細胞移植后

6、的第1個月，提示廣大醫(yī)護人員應高度警惕CDI的發(fā)生。該研究為合理應用抗生素，預防CDI，提高診療效率并控制CDI的流行提供了參考。
　　第二部分 艱難梭菌感染患者腸道菌群結構多樣性研究
　　目前能有效治療CDI的藥物是萬古霉素和甲硝唑，但治療后3個月內兩者的復發(fā)率在10％-30％左右。對于復發(fā)、難治性CDI，經常規(guī)治療無效后可以考慮糞便菌群移植治療，以恢復患者腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減少艱難梭菌定植。糞便菌群移植是現今治療復發(fā)性、難治

7、性CDI最有效的方法之一，治療成功率可達83％-92％，這提示我們腸道菌群在治療CDI及對預防其復發(fā)有重要的作用。然而，糞便菌群移植因可能存在未知風險，缺乏長期有效性和安全性研究、挑戰(zhàn)患者心理承受能力等原因而沒有被廣泛推廣。因此進一步明確糞便菌群中治療CDI的關鍵細菌種類，提取腸道有益菌群是未來的重要發(fā)展方、向。
　　本研究利用16S rDNA測序法和熒光定量PCR法對15例CDI患者、18例非艱難梭菌感染院內腹瀉患者(C.dif

8、ficile-negative nosocomial diarrhea，CDN)和25例健康對照人群的糞便菌群結構進行了全面分析以尋找與CDI相關的關鍵細菌種類。三組間多樣性參數比較和基于Spearman距離的主坐標分析結果都顯示健康對照人群和CDI、CDN患者的腸道菌群結構具有顯著差異。研究發(fā)現CDI患者與產丁酸相關的厭氧菌比例如毛螺菌科細菌、瘤胃球菌科細菌比例顯著降低，與產乳酸相關的細菌比例則顯著升高，與產內毒素相關的腸道潛在致病菌

9、如腸桿菌科細菌比例明顯增加，而具有抗炎作用的柔嫩梭菌類群及其中最具代表性的Faecalibacterium prausnitzii比例顯著減少，這些菌群結構改變可能與增加艱難梭菌定植的易感性有關。我們的研究結果可以為以調節(jié)腸道菌群為治療手段治療CDI提供理論依據。
　　第三部分 艱難梭菌感染患者糞便上清代謝組學研究
　　腸道微生態(tài)是人體最為重要的微生態(tài)系統(tǒng)，相當于一個重要的代謝“器官”。我們對于CDI患者腸道菌群結構的改變與

10、代謝如何關聯還知之甚少，因此要從代謝水平對艱難梭菌感染與腸道菌群關系進行深入探索。
　　本研究通過超高效液相色譜-質譜代謝組學分析方法，對CDI、CDN患者和健康對照人群糞便上清的代謝物質進行檢測。采用主成分分析、偏最小二乘法判別分析及正交偏最小二乘法判別分析對三組UPLC/MS數據進行代謝模式分析，結果顯示CDI、CDN患者和健康對照人群代謝譜有顯著不同。我們鑒定得到20種特征性代謝產物（主要是與膽汁酸代謝、膽紅素代謝、氨基酸代