小鼠乳腺原基中干細(xì)胞定位及其再生功能性乳腺.pdf

1、由于乳腺組織結(jié)構(gòu)及發(fā)育特點，其已經(jīng)成為發(fā)育相關(guān)研究的理想模型之一。在乳腺發(fā)生、發(fā)育以及不同時期的增殖、衰退過程中，始終貫穿著乳腺干細(xì)胞的白我更新、增殖分化。本試驗中乳腺原基中干細(xì)胞的定位、乳腺原基移植再生乳腺以及乳腺發(fā)生、發(fā)育機(jī)制研究可以為人類乳腺疾病治療、因疾病切除后的乳腺再生等臨床應(yīng)用和對家畜乳腺改造以生產(chǎn)某種珍貴蛋白、提高家畜哺乳能力和產(chǎn)奶量等提供新的思路和技術(shù)支持。 乳腺干細(xì)胞及不同類型的細(xì)胞群在乳腺原基中的定位有助于

2、止常乳腺發(fā)育分子機(jī)制的闡明。本研究利用細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特點和干細(xì)胞及其他不同細(xì)胞類群的分子標(biāo)記進(jìn)行了這些細(xì)胞在原基中的定位。電鏡技術(shù)以顯示原基中不同部位不同類群細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特點。利用帶熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞角蛋白抗體顯示乳腺原基的輪廓，以此為參照，進(jìn)一步定位Sca-1、CD10、Muc-1和CD34陽性細(xì)胞在原基中的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sca-1陽性細(xì)胞定位于原基中近邊緣區(qū)域，而此區(qū)域細(xì)胞富集有淡染細(xì)胞，這些淡染細(xì)胞表現(xiàn)為核質(zhì)、胞質(zhì)淡染，細(xì)胞器稀少

3、，缺少粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，無細(xì)胞極性。其他細(xì)胞類群分布在原基的中部(Muc-1)或頸部區(qū)域(CD34)，而CD10陽性細(xì)胞則散布于乳腺原基中。 乳腺原基移植可以挽救轉(zhuǎn)基因致死動物的乳腺，使其在受體脂肪墊中繼續(xù)發(fā)育，研究轉(zhuǎn)基因與乳腺發(fā)育之間的關(guān)系。本研究以轉(zhuǎn)抗人漢坦病毒抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型為試驗材料，將其乳腺原基移植于清除乳腺的野生型小鼠脂肪墊中，并利用PCR、RT-PCR、原位雜交、H.E.染色、WesternBlotting、免

4、疫組化等方法對再生乳腺進(jìn)行系統(tǒng)檢測。試驗結(jié)果表明，乳腺原基移植再生率為44.4％(24/54)；再生乳腺中含有轉(zhuǎn)基因，并且在RNA水平和蛋白質(zhì)水平能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因；轉(zhuǎn)基因表達(dá)量和表達(dá)方式僅與供體乳腺原基，即轉(zhuǎn)基因在供體鼠基因組中的整合方式有關(guān)，而與移植受體鼠無關(guān)。進(jìn)一步研究表明，乳腺原基移植可以再生能夠分泌重組單克隆抗體的乳腺組織，能夠重演乳腺發(fā)育的整個過程，是一個良好的乳腺發(fā)育研究的技術(shù)平臺。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在移植后6周和移植受體鼠分娩后2

5、-3天，再生乳腺組織大小比同時期正常乳腺組織較小(1.4：1.84；2.47：3.6cm2)，而比對照組脂肪墊大(1.14；1.88cm2)。這說明，在乳腺發(fā)育過程中，乳腺導(dǎo)管、腺泡與乳腺脂肪組織相互促進(jìn)增殖，進(jìn)而使乳腺組織體積增大。 為進(jìn)一步闡明乳腺原基發(fā)育的機(jī)制，將E14.5天乳腺原基完整或撕碎后移植于免疫缺陷鼠背部皮下，并給受體鼠注射雌激素、孕激素和促乳素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，撕碎后乳腺原基的大部分細(xì)胞均能形成導(dǎo)管，但不能形成分叉

6、。而完整的乳腺原基僅能從沒有間葉細(xì)胞層的頸部延伸出一些導(dǎo)管。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，再生的導(dǎo)管呈ER、PR陽性，促乳素處理后，其內(nèi)壁細(xì)胞呈現(xiàn)β-casein陽性。另外，乳腺原基在體外超低黏附培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞能增殖形成集落。這說明，乳腺原基中富含乳腺干/祖細(xì)胞，這些細(xì)胞在脫離正常體內(nèi)環(huán)境的情況下仍具有形成導(dǎo)管的潛能，但沒有來自乳腺脂肪細(xì)胞的信號時，不能形成分叉。再生的導(dǎo)管內(nèi)壁細(xì)胞能表達(dá)β-酪蛋白，這說明乳腺的形態(tài)發(fā)育與其功能的獲得是兩個獨(dú)立