hBMP2與hVEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合n-HA-PA66組織工程骨構(gòu)建及檢測.pdf

1、背景:組織工程骨由種子細(xì)胞、外源生長因子、支架材料三部分構(gòu)成。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)被認(rèn)為是良好的種子細(xì)胞，其在骨修復(fù)應(yīng)用方面已顯示出良好的效果;在骨缺損修復(fù)中有多種細(xì)胞生長因子參與，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein2，BMP2）被認(rèn)為是誘導(dǎo)成骨分化作用的關(guān)鍵生物活性物質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族的一員，它參與調(diào)節(jié)

2、細(xì)胞增殖、種系分化、細(xì)胞死亡等一系列的生物過程;血管內(nèi)皮生長因子165(Vascularendothelia growth factor165，VEGF165)在血管再生和骨組織再生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究證實(shí)，納米羥基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66，n-HA/PA66)具有良好的生物力學(xué)性、生物安全性和相容性，臨床工作中已將其作為修復(fù)支架材料開始應(yīng)用。然而單獨(dú)應(yīng)用n-HA/PA

3、66修復(fù)骨缺損尚存在缺陷和不足。因此，選擇細(xì)胞生長因子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSCs獲得持續(xù)、高效表達(dá)外源生長因子，以克服外源性生長因子在體內(nèi)易充散、效價低、時效短等問題。
　　初期動物實(shí)驗(yàn)表明，BMP2和VEGF165蛋白質(zhì)在骨缺損修復(fù)中獲得良好的治療效果。我們此次實(shí)驗(yàn)基于之前的研究，通過基因工程構(gòu)建腺病毒Ad-BMP2-VEGF165，轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合n-HA/PA66，檢測hBMP2和hVEGF165目的基因的表達(dá)及成骨細(xì)胞分化的

4、活動，旨在為體外組織工程骨構(gòu)建提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，同時為課題后期動物體內(nèi)骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)奠定良好的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定，獲得良好的組織工程骨種子細(xì)胞。
　　2.hBMP2與hVEGF165雙基因共表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得高效、持續(xù)外源生長因子表達(dá)載體。
　　3.體外hBMP2與hVEGF165雙基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合n-HA/PA66，構(gòu)建及檢測

5、組織工程骨生物學(xué)表達(dá)，為組織工程骨體內(nèi)成骨研究提供分子生物學(xué)的方面技術(shù)支持和理論依據(jù)，同時為課題后期動物體內(nèi)骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)奠定好細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用密度梯度離心法分離BMSCs，倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs的大體形態(tài)，成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后，茜素紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)生成情況;取第3代BMSCs進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。
　　2.通過PCR方法從cDNA文庫中擴(kuò)增BMP2和VEGF165基因，連接到腺病毒

6、穿梭質(zhì)粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF165。然后再與腺病毒輔助質(zhì)粒pBHGlox△(delta) E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒Ad-BMP2-VEGF165，經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增純化后測定病毒滴度。將重組腺病毒轉(zhuǎn)染預(yù)先凍存的BMSCs，不同時間點(diǎn)觀察目的基因蛋白表達(dá)。
　　3.取第3代BMSCs作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對象，實(shí)驗(yàn)共分2組:Ad-BMP2-V

7、EGF165為實(shí)驗(yàn)組和Ad-GFP為對照組;首先用不同感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染BMSCs，并進(jìn)行ELISA和Westem blot檢測細(xì)胞hBMP2和hVEGF165的表達(dá);其次將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到n-HA/PA66生物材料上，7d后掃描電鏡觀察細(xì)胞貼附、生長狀況;同時，7d后消化收集貼附n-HA/PA66上的細(xì)胞，Westem blot檢測貼附生物材料細(xì)胞中骨鈣素(Osteocalcin，OC)和骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)的表達(dá)。

8、
　　結(jié)果:
　　1.密度梯度離心法獲得乳白色單個核細(xì)胞層，分離得到BMSCs，24 h后倒置顯微鏡下觀察，少許細(xì)胞開始貼壁生長，散在分布，呈小梭形或多邊形;48h后首次換液，隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞呈梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀或人字狀排列，原代細(xì)胞6-8 d即可達(dá)到80％融合，傳代后細(xì)胞呈梭形，形態(tài)大小較一致。BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后茜素紅染色可見桔紅色鈣結(jié)節(jié)形成;第3代細(xì)胞表面高表達(dá)CD29(99.82％)和CD44(94

9、.14％)，低表達(dá)CD14(3.11％)和CD34(0.34％)。
　　2.基因測序、菌落PCR、Western blot、GFP表達(dá)均觀察證實(shí)重組腺病毒載體Ad-BMP2-VEGF165構(gòu)建成功，滴度達(dá)1×1010PFU/ml。Ad-BMP2-VEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs后，培養(yǎng)液中BMP2與VEGF165及Ad-BMP2組中BMP2在3-28 d均有表達(dá)，但是3-5 d時蛋白表達(dá)量最高，且與其他時間點(diǎn)相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5d以

10、后蛋白表達(dá)量逐漸減少，具有時間依賴性。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染后hBMP2和hVEGF165蛋白水平高表達(dá);掃描電鏡見轉(zhuǎn)染細(xì)胞分布均勻，生長狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，復(fù)合n-HA/PA66后Western Blot檢測顯示OC和OPN表達(dá)均較高，兩組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定成功，早代細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，可作為良好的種子細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.攜帶