金納米棒介導(dǎo)的靶向DC沉默 IDO聯(lián)合Flt3-L體內(nèi)擴(kuò)增DC技術(shù)治療小鼠肺癌的研究.pdf

1、目的：
　　樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell，DC）是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，成熟的DC能有效激活初始型T細(xì)胞，是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，但DC能產(chǎn)生一些如吲哚胺2,3-雙加氧酶（Indoleamine2,3-deoxygenase,IDO）的重要的免疫負(fù)調(diào)控分子，它可以使腫瘤逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，改變腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，從而影響DC疫苗臨床治療的效果。本研究應(yīng)用納米技術(shù)構(gòu)建能靶向DC沉默IDO的新型

2、金納米棒（Gold nanorod，GNR）導(dǎo)入系統(tǒng)GNR-MUA-PEI-Man/siIDO，探討其對(duì)DC的靶向性、siIDO沉默效應(yīng)、評(píng)估該納米靶向系統(tǒng)聯(lián)合Flt3-L體內(nèi)擴(kuò)增DC技術(shù)對(duì)小鼠肺癌的治療效果。
　　方法：
　　1.GNR-MUA-PEI-Man系統(tǒng)的創(chuàng)建：借鑒經(jīng)典的金納米棒的晶種子溶液生長法合成本實(shí)驗(yàn)所需金納米棒，并對(duì)金納米棒進(jìn)行進(jìn)一步的功能化修飾。通過透射電鏡觀察金納米棒修飾前后大小、分散度；酶標(biāo)儀檢測(cè)紫

3、外光譜，觀察其局域表面等離子共振效應(yīng)；并通過核磁共振檢測(cè)修飾后金納米棒表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
　　2.通過CCK8試劑檢測(cè)金納米棒修飾前后對(duì)細(xì)胞的毒性。
　　3.金納米棒與siIDO按照不同的質(zhì)量比連接，通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)合情況。4.流式細(xì)胞技術(shù)觀察GNR-MUA-PEI-Man/cy3-siGAPDH對(duì)DC的靶向轉(zhuǎn)染效率，并確定最佳轉(zhuǎn)染濃度和轉(zhuǎn)染時(shí)間。
　　5.Q-PCR檢測(cè)GNR-MUA-PEI-Man/siIDO

4、對(duì)DC的IDO沉默效果。
　　6.將GNR-MUA-PEI-Man/siGAPDH尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，48h后取其心肝脾肺腎制成冰凍切片，觀察體內(nèi)靶向作用。
　　7.將GNR-MUA-PEI-Man/siIDO尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)，聯(lián)合Flt3-L體內(nèi)擴(kuò)增DC，治療小鼠肺癌，觀察治療效果。
　　8.取各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟細(xì)胞，檢測(cè)Flt3-L體內(nèi)擴(kuò)增DC的效果及T細(xì)胞的凋亡情況。
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5、.磁珠分選出小鼠脾臟CD11c+DC，檢測(cè) DC的成熟度以及 GNR-MUA-PEI-Man/IDO的體內(nèi)IDO沉默效果。
　　10.磁珠分選出各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用，及CD4+T細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果：
　　1.功能化修飾后的金納米棒（GNR-MUA-PEI-Man）的紫外可見吸收峰發(fā)生明顯紅移至810nm，透射電子顯微鏡下觀察到其大小未見明顯改變、分散度良好

6、，核磁共振成功檢測(cè)到其表面的甘露糖六元雜環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　2.GNR-MUA-PEI-Man對(duì)細(xì)胞的毒性明顯降低，生物相容性、生物安全性明顯提高。
　　3.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明GNR-MUA-PEI-Man與siIDO的質(zhì)量比在2:1時(shí)，兩者剛好全部結(jié)合。
　　4.流式檢測(cè)表明GNR-MUA-PEI-Man與siIDO的比例為5:1時(shí)，轉(zhuǎn)染24h后，對(duì)DC的轉(zhuǎn)染效率達(dá)最高，為70％。
　　5.Q-PCR檢測(cè)GNR-MUA

7、-PEI-Man/siIDO體外轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞48h后，對(duì)IDO的沉默效率可達(dá)71.2%，且沉默IDO后，可明顯促進(jìn)DC的成熟度。
　　6.冰凍切片結(jié)果顯示，GNR-MUA-PEI-Man/Cy3-siGAPDH尾靜脈注射48h后，熒光物質(zhì)主要蓄積在富含DC等單核-巨噬細(xì)胞的脾臟、肝臟內(nèi)；余組織器官內(nèi)未見明顯蓄積。
　　7.將GNR-MUA-PEI-Man/siIDO尾靜脈注射至C57BL/6小鼠體內(nèi)能有效地沉默體內(nèi)DC ID

8、O的表達(dá)，聯(lián)合Flt3-L體內(nèi)擴(kuò)增DC，可明顯抑制肺癌的增長。
　　8.通過本研究建立的GNR-MUA-PEI-Man/siIDO下調(diào)小鼠體內(nèi)DC的IDO表達(dá)后，小鼠體內(nèi)的T細(xì)胞的凋亡減少，細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)，CD4+T細(xì)胞的增殖能力增加。
　　結(jié)論：
　　1.本研究構(gòu)建的GNR-MUA-PEI-Man基因載體能有效地靶向轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入DC，并沉默靶分子。
　　2.GNR-MUA-PEI-Man/s