青蒿AaCMK、AaMCT、AaMCS基因的克隆與功能分析.pdf

1、青蒿素（Artemisinin）是從青蒿（Artemisia annua L.）中提取的一種具有獨(dú)特過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯。青蒿素聯(lián)合療法（ACTs）是世界衛(wèi)生組織推薦治療瘧疾的首選方法。此外青蒿素衍生物對(duì)治療病毒感染、癌癥、免疫疾病也有重要的藥用價(jià)值。然而，青蒿中青蒿素含量很低（約0.01％-0.8%），青蒿素分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，很難采用全化學(xué)合成的方法生產(chǎn)青蒿素。因而克隆青蒿素前體合成途徑上的基因，為青蒿素代謝工程提供候選基因和作用靶

2、點(diǎn)就十分必要。
　　MEP途徑定位于植物細(xì)胞的質(zhì)體中，為包括青蒿素在內(nèi)的萜類合成提供基本前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(IPP)和其同分異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶(MCT)、4-磷酸胞苷-2-甲基赤蘚糖激酶（CMK）、2-甲基赤蘚糖-2,4-環(huán)二磷酸合成酶（MCS）分別是MEP途徑的第三、第四、第五個(gè)關(guān)鍵酶。MCT催化2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）生成4-(5′-焦磷

3、酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇（CDP-ME）；CMK催化 CDP-ME合成4-（5′-二磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸（CDP-ME-2P）；MCS催化CDP-ME-2P生成2-甲基赤蘚糖-2,4-環(huán)二磷酸（ME-cPP）。
　　本文首次克隆了青蒿MCT基因全長(zhǎng)cDNA（AaMCT）、CMK基因全長(zhǎng)cDNA（AaCMK）、MCS基因全長(zhǎng) cDNA（AaMCS）并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。AaMCT的cDNA全

4、長(zhǎng)1176 bp（GenBank登錄號(hào)：KU365210），包含906 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼302個(gè)氨基酸。AaCMK的cDNA全長(zhǎng)1462 bp（GenBank登錄號(hào)：KT778821），包含1197 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼399個(gè)氨基酸。AaMCS的cDNA全長(zhǎng)811 bp（GenBank登錄號(hào)：KT725782），包含678 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼226個(gè)氨基酸?；虮磉_(dá)結(jié)果表明：AaMCT、AaCMK、AaMCS在青蒿分泌型腺

5、體中大量表達(dá)，在葉、花、莖和根中少量表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，AaMCT、AaCMK、AaMCS受到MeJA和SA誘導(dǎo)表達(dá)，MeJA處理后AaMCT、AaCMK、AaMCS基因的表達(dá)量呈極顯著提高（P<0.01），SA處理后AaMCT和AaCMK基因的表達(dá)量呈顯著提高（P<0.05）。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示：AaMCT、AaCMK、AaMCS分別融合GFP都特異性定位在葉綠體中，這與MEP途徑定位于質(zhì)體這一事實(shí)吻合。最后，在擬南芥中分別超量表達(dá)AaM

6、CT、AaCMK、AaMCS基因，擬南芥中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量都得到顯著提高（P<0.01）。轉(zhuǎn)AaMCT基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素a含量與對(duì)照相比分別提高了22.09%、16.60%、21.05%；轉(zhuǎn)AaMCT基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素b含量與對(duì)照相比分別提高了23.70%、18.00%、17.43%；轉(zhuǎn)AaMCT基因擬南芥三個(gè)株系的類胡蘿卜素含量與對(duì)照相比分別提高了18.60%、11.53%、21.45%。轉(zhuǎn) AaCM

7、K基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素a含量與對(duì)照相比分別提高了23.83%、22.27%、18.26%；轉(zhuǎn)AaCMK基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素b含量與對(duì)照相比分別提高了27.21%、22.79%、18.38%；轉(zhuǎn)AaCMK基因擬南芥三個(gè)株系的類胡蘿卜素含量與對(duì)照相比分別提高了25.24%、16.50%、15.53%。轉(zhuǎn)AaMCS基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素a含量與對(duì)照相比分別提高了16.04%、12.69%、21.38%；轉(zhuǎn)AaMCS基因擬南芥三