藏花酸對(duì)CYP3A4、1A2酶活性的影響研究.pdf

1、藏花酸(Crocetin)又名番紅花酸或西紅花酸,為磚紅色正交結(jié)晶,具有多不飽和共軛烯酸結(jié)構(gòu),來(lái)源于茜草科植物梔子果實(shí),屬類胡蘿卜素物質(zhì),是藏紅花的主要有效成分之一。其藥理作用主要涉及呼吸、神經(jīng)、心血管及泌尿系統(tǒng)等各方面。本課題組前期研究表明Crocetin主要經(jīng)CYP3A4、1A2酶代謝。但Crocetin是否對(duì)CYP450酶活性存在影響及與其他藥物合用是否會(huì)產(chǎn)生相互作用等并未進(jìn)行過(guò)深入探討。因此本課題首先通過(guò)大鼠及人肝微粒體孵育體系

2、在體外水平研究Crocetin對(duì)CYP3A4、1A2酶的影響,然后再結(jié)合大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步考察Crocetin對(duì)CYP3A酶活性的影響,以期為Crocetin在臨床的合理應(yīng)用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)體外人、大鼠肝微粒體模型研究Crocetin對(duì)主要代謝酶CYP3A4、1A2酶活性的影響,再結(jié)合大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步考察Crocetin對(duì)CYP3A酶活性的影響,為Crocetin的研究提供更多理論依

3、據(jù)。
　　方法:
　　1.建立檢測(cè)大鼠肝微粒體中咪達(dá)唑侖(MDZ)、非那西丁(PHE)及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立檢測(cè)大鼠血漿中MDZ的HPLC方法;
　　3.在體外大鼠、人肝微粒體溫孵體系中建立MDZ和PHE各自的最佳溫孵時(shí)間、最佳蛋白濃度及最適底物濃度;
　　4.通過(guò)體外大鼠、人肝微粒體模型,研究各劑量Crocetin對(duì)大鼠、人肝微粒體CYP3A4、CYP1A2亞酶活性的影

4、響;
　　5.通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),考察單次腹腔注射不同劑量Crocetin,尾靜脈注射相同劑量的MDZ后,Crocetin對(duì)CYP3A介導(dǎo)的MDZ藥代動(dòng)力學(xué)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.建立了檢測(cè)大鼠肝微粒體中MDZ、PHE及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC方法;
　　2.建立了檢測(cè)大鼠血漿中MDZ的HPLC方法;
　　3.在大鼠肝微粒體實(shí)驗(yàn)中,MDZ在37℃,120r/min的條件下進(jìn)行孵育,在1-40

5、min內(nèi),MDZ的消除量隨時(shí)間的增加而明顯增加,故選擇的最佳孵育時(shí)間為40min;當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?.05-0.3mg/ml范圍內(nèi)時(shí),蛋白濃度越大,MDZ的消除量就越大,因此確定最佳蛋白濃度為0.3mg/ml;當(dāng)?shù)孜镌?.5-10μM濃度范圍內(nèi)時(shí),MDZ代謝量隨底物濃度的升高而增加,當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)10μM時(shí),MDZ代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此,確定的最佳底物濃度為10μM。PHE在37℃,120r/min的條件下進(jìn)行孵育,5-40

6、min內(nèi),PHE呈線性消除,當(dāng)超過(guò)40min時(shí),PHE消除量很少變化,所以我們選擇的最佳孵育時(shí)間為40min;在0.1-0.4mg/ml范圍內(nèi),蛋白濃度越大,PHE的消除量就越多,故確定最佳蛋白濃度為0.4mg/ml;而當(dāng)?shù)孜镌?-80μM濃度范圍內(nèi)時(shí),PHE代謝量隨底物濃度的升高而增加,當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)80μM時(shí),PHE代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此選擇的最適底物濃度為80μM;
　　4.在體外大鼠肝微粒體實(shí)驗(yàn)中,Croc

7、etin在濃度為0.5-80μM時(shí)對(duì)CYP3A的酶活性影響均有顯著性差異(P＜0.05)。MDZ在Crocetin濃度為0.5-80μM時(shí)代謝量的均數(shù)分別降低了15.55％、35.27％、48.77％、59.74％、61.72％、67.88％、71.11％(P＜0.05)。Crocetin在濃度為0.5-80μM時(shí)對(duì)CYP1A2的酶活性影響同樣均有顯著性差異(P＜0.05)。PHE在Crocetin濃度為0.5-80μM時(shí)代謝量的均數(shù)分

8、別降低了10.17％、21.38％、33.43％、52.09％、63.01％、77.32％、81.24％(P＜0.05)。且Crocetin對(duì)CYP3A、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分別為6.814μM、9.157μM;
　　5.在人肝微粒體實(shí)驗(yàn)中,MDZ在37℃,120r/min的條件下進(jìn)行孵育,在1-30min內(nèi),MDZ的消除量隨時(shí)間的增加而明顯增加,當(dāng)超過(guò)30min時(shí),MDZ的消除量不再隨時(shí)間的增加而增加,故選擇的

9、最佳孵育時(shí)間為30min;當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?.05-0.2mg/ml范圍內(nèi)時(shí),MDZ呈線性消除,因此確定最佳蛋白濃度為0.2mg/ml;當(dāng)?shù)孜镌?.5-10μM濃度范圍內(nèi)時(shí),MDZ代謝量隨底物濃度的升高而增加,當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)10μM時(shí),MDZ代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此,確定的最佳底物濃度為10μM。PHE在37℃,120r/min的條件下進(jìn)行孵育,5-40min內(nèi),PHE的消除量隨時(shí)間的增加而增加,當(dāng)超過(guò)40min時(shí),PHE消除

10、量很少變化,所以我們選擇的最佳孵育時(shí)間為40min;在0.1-0.4mg/ml范圍內(nèi),PHE呈線性消除,故確定最佳蛋白濃度為0.4mg/ml;而當(dāng)?shù)孜镌?-80μM濃度范圍內(nèi)時(shí),PHE代謝量隨底物濃度的升高而增加,當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)80μM時(shí),PHE代謝量不再隨底物濃度的升高而增加,因此選擇的最適底物濃度為80μM;
　　6.在體外人肝微粒體中,Crocetin在濃度為0.5-80μM時(shí)對(duì)CYP3A4的酶活性影響均有顯著性差異(P＜0

11、.01)。MDZ在Crocetin濃度為0.5-80μM時(shí)代謝量的均數(shù)分別降低了25.36％、32.37％、38.91％、45.96％、51.74％、59.24％、67.72％(P＜0.01)。Crocetin在濃度為0.5-80μM時(shí)對(duì)CYP1A2的酶活性影響同樣均有顯著性差異(P＜0.05)。PHE在Crocetin濃度為0.5-80μM時(shí)代謝量的均數(shù)分別降低了13.48％、30.55％、33.72％、42.67％、48.01％、5

12、6.62％、67.43％(P＜0.01)。且Crocetin對(duì)CYP3A4、CYP1A2抑制50％酶活性的IC50分別為13.271μM、19.225μM;
　　7.四組MDZ主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù):空白組AUC(0-t)(361.209mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(403.953mg·L·min-1)、MRT(0-t)(37.78 min)、MRT(0-∞)(62.362min)、t1/2z(42.193 min)、CLz(

13、0.07 L·min-1·kg-1)、Vz(1.135 L·kg-1);低劑量組AUC(0-t)(454.895mg·L·min-1)、AUC(0-∞)(499.209mg·L· min-1)、MRT(0-t)(49.004 min)、MRT(0-∞)(75.421 min)、t1/2z(52.806 min)、CLz(0.024 L·min-1·kg-1)、Vz(0.785 L·kg-1);中齊劑量組AUC(0-t)(636.417m

14、g·L·min-1)、AUC(0-∞)(704.421 mg·L·min-1)、MRT(0-t)(57.212 min)、MRT(0-∞)(92.241 min)、t1/2z(64.404 min)、CLz(0.017L· min-1· kg-1)、Vz(0.553 L·kg-1);高劑量組 AUC(0-t)(1050.388mg·L·min-11)、AUC(0-∞)(1177.015mg·L·min-1)、MRT(0-t)(64.68

15、1 min)、MRT(0-∞)(107.915 min)、t1/2zz(77.145 min)、CLz(0.006L·min-1·kg-1)、Vz(0.316L·kg-1)。結(jié)果表明給藥組MDZ的藥-時(shí)曲線下面積明顯比對(duì)照組高,提示Crocetin對(duì)MDZ的血藥濃度存在明顯影響,且該影響隨Crocetin濃度的增高而加強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1.建立的大鼠肝微粒體中MDZ、PHE及人肝微粒體中MDZ、PHE的HPLC檢測(cè)方法靈

16、敏可靠;
　　2.建立的大鼠血漿中MDZ的HPLC檢測(cè)方法靈敏可靠;
　　3.在大鼠肝微粒體中,Crocetin對(duì)CYP1A2、CYP3A亞酶活性呈中等程度抑制作用;
　　4.在人肝微粒體中,Crocetin對(duì)CYP1A2、CYP3A4亞酶活性則呈現(xiàn)較弱的抑制作用;
　　5.在大鼠體內(nèi),給藥組MDZ的藥-時(shí)曲線下面積明顯比對(duì)照組高,提示Crocetin對(duì)MDZ的血藥濃度存在明顯影響,且該影響隨Crocetin濃度