SARS冠狀病毒核衣殼蛋白對(duì)細(xì)胞色素氧化酶CYP450(CYP4F3A)酶活性影響的研究.pdf

1、核衣殼蛋白(N蛋白)是SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一,與病毒RNA結(jié)合形成核衣殼,能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫,在SARS的診斷和預(yù)防上具有重要的應(yīng)用。與其它冠狀病毒N蛋白不同,SARS-CoV N蛋白定位于細(xì)胞質(zhì),參與SARS冠狀病毒RNA合成的調(diào)控以及核衣殼的形成。并且,SARS-CoV N蛋白能結(jié)合人親環(huán)素(hCypA)解離病毒核心,激活A(yù)P-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而干擾宿主細(xì)胞分裂,在生長(zhǎng)因子缺乏的情況下

2、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。前期工作發(fā)現(xiàn)N蛋白可能在SARS冠狀病毒感染過(guò)程中起重要作用。為了研究SARS-CoV N蛋白參與炎癥反應(yīng)的分子機(jī)理,以全長(zhǎng)N蛋白為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交篩選人胎肝cDNA文庫(kù)時(shí),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450(CYP4F3A)與SARS-CoV N蛋白相互作用。CYP4F3A是炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白,其相互作用很可能與SARS病毒的致病性相關(guān)。
　　本研究建立了CYP4F3A在體外的酶促反應(yīng)體系及其動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定方法

3、,并通過(guò)一系列離子交換層析、分子篩凝膠過(guò)濾層析、免疫沉淀、免疫印跡以及ELISA證明,SARS-CoV N蛋白與CYP4F3A結(jié)合可以抑制CYP4F3A的ω-羥化酶活性,從而抑制炎癥因子LTB4的降解。N蛋白在體外抑制CYP4F3A的酶活,使其Km’值從2.5μmol/L變?yōu)?0.2μmol/L,而加入229E N蛋白后Km’僅變化為4.82μmol/L。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)尾靜脈注射N蛋白在LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥模型中起促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。Sil

4、ybin是從植物水飛薊中提取的黃酮類化合物,具有抑制5-酯氧酶的作用,從而間接阻斷了LTB4的合成。當(dāng)在LPS注射前1h給予藥物Silybin,LTB4濃度比未給藥組低。說(shuō)明Silybin可以通過(guò)阻斷炎癥介質(zhì)的生成來(lái)保護(hù)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的急性肺損傷。并且,當(dāng)肌肉注射表達(dá)N蛋白的質(zhì)粒并腹腔注射LPS的小鼠血清中LTB4水平與對(duì)照組相比升高。將質(zhì)粒與MDP-C(胞壁肽佐劑)一起通過(guò)靜脈免疫家兔,動(dòng)物產(chǎn)生顯著的過(guò)敏樣反應(yīng)。小鼠和家兔肺部及腸道中