神經(jīng)酰胺類似物抑制腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞的分子機制.pdf

1、腫瘤免疫治療是利用免疫學(xué)原理和方法，對機體本身的免疫功能進行激發(fā)和增強，從而達到殺死腫瘤細胞、抑制腫瘤生長的效果。目前研究免疫療法對抗癌癥的方法中較有進展的是單克隆抗體療法、癌癥疫苗療法和免疫細胞療法。在2013年的《科學(xué)》雜志上，腫瘤免疫治療被評為年度十大科學(xué)進展的第一位。然而，盡管機體有多種抗腫瘤免疫應(yīng)答，但腫瘤仍可在體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展，并且隨著腫瘤的增長，腫瘤細胞能產(chǎn)生一些細胞因子。這些因子可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一些抑制免疫的細胞，從而抑制

2、抗腫瘤的免疫功能。免疫抑制細胞包括未成熟的樹突狀細胞(iDC)、腫瘤相關(guān)的巨噬細胞（TAM）、骨髓來源的抑制細胞(MDSC)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)。具有生物活性的鞘脂類代謝產(chǎn)物，特別是神經(jīng)酰胺(Cer)，鞘氨醇(Sph)和1-磷酸鞘氨醇(S1P)，作為重要的生物效應(yīng)分子，參與調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)錄，引起細胞增值或死亡。近年來關(guān)于神經(jīng)酰胺類似物的研究發(fā)展較迅速，人們發(fā)現(xiàn)多種神經(jīng)酰胺類似物在抗腫瘤研究中存在較大潛力。但是這些類似物在腫瘤免疫抑制細

3、胞中的作用機制是十分不清楚的。本論文從體內(nèi)和體外環(huán)境下，考察神經(jīng)酰胺類似物對腫瘤免疫抑制細胞的作用，并探究這一過程中比較完善的信號傳導(dǎo)途徑，這可能為進一步深入闡明神經(jīng)酰胺類似物在腫瘤免疫逃避中的作用機制提出新的觀點，并可能為研發(fā)針對腫瘤免疫抑制細胞為靶點的治療方法提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　本文的主要研究結(jié)論如下:
　　1.荷瘤小鼠中CD11b+Gr1+MDSCs的比例升高，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)移性肉瘤細胞CMS4-m

4、et接種在BALB/c小鼠的皮下，一個月后，經(jīng)過流式細胞儀檢測分析，與未接種腫瘤的空白對照組相比，實驗組小鼠脾細胞、骨髓細胞和血細胞中CD11b+Gr1+MDSCs細胞比例明顯提高。這表明腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞的增加會促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　2.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521在動物模型中降低了脾和腫瘤組織中CD11b+Gr1+MDSCs的百分比，抑制腫瘤的生長。轉(zhuǎn)移性肉瘤細胞CMS4-met接種在BALB/c小鼠的皮下，一個月后，

5、靜脈注射LCL521(75mg/kg.bw)兩次，每隔一天一次，采集得到荷瘤小鼠對照組和給藥組的脾細胞、腫瘤細胞、骨髓細胞和血細胞，流式細胞儀檢測分析CD11b+Gr1+MDSCs的含量變化。結(jié)果顯示:相比對照組，給藥組中脾組織和腫瘤組織的MDSCs細胞百分比明顯減少，表明在小鼠體內(nèi)實驗中LCL521明顯降低MDSCs的含量。具有60-70mm3大小腫瘤的荷瘤小鼠在施加LCL521藥物作用7天（1次/天，共6次）后，給藥組腫瘤體積能有效

6、得到抑制，表明LCL521對腫瘤的生長也起到有效得到抑制作用。
　　3.J774和RAW兩種細胞可以分別作為MDSCs和巨噬細胞的體外模型。流式細胞儀檢測分析表明J774細胞絕大部分表現(xiàn)出CD11b、Gr1雙陽性，而RAW主要是CD11b陽性而Gr1陰性。故我們采用J774作為CD11b+ Grl+MDSCs的體外細胞模型，而RAW則作為巨噬細胞的體外模型，用于研究神經(jīng)酰胺類似物對腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞的作用及其分子機制。

7、　　4.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521誘導(dǎo)J774、RAW細胞死亡排除了凋亡、程序性細胞死亡、細胞自噬的可能途徑。采用PI染色檢測，結(jié)果顯示LCL521引起J774、RAW這兩種細胞濃度依賴性的死亡。為了進一步探究LCL521誘導(dǎo)細胞細胞死亡的途徑，我們分別使用了Caspase的抑制劑、RIP1和RIP3的抑制劑、自噬的抑制劑，結(jié)果均未表現(xiàn)出對LCL521誘導(dǎo)的細胞死亡產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用。即LCL521誘導(dǎo)J774、RAW細胞死亡的途徑不是凋亡，

8、不是程序性細胞死亡，也不是細胞自噬。
　　5.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521對J774、RAW細胞的作用靶點位于線粒體和溶酶體。經(jīng)過LCL521處理的J774、RAW細胞采用超高速密度梯度離心和線粒體分離方法，我們分別成功分離到了溶酶體和線粒體，將兩種細胞器的溶解產(chǎn)物分別經(jīng)過LC-MS/MS檢測分析，發(fā)現(xiàn)大量LCL521定位于溶酶體和線粒體。同時，我們還發(fā)現(xiàn)鞘氨醇在溶酶體和線粒體上的含量均明顯降低。
　　6.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL

9、521造成線粒體上Ca2+的過載，引起細胞內(nèi)ROS的升高，最終導(dǎo)致J774和RAW細胞死亡。經(jīng)過LCL521處理的J774、RAW細胞采用Ca2+的指示劑Rhod-2-AM和Fluo-3-AM，ROS的指示劑DCFDA檢測，發(fā)現(xiàn)線粒體和細胞液的Ca2+濃度都明顯升高，細胞內(nèi)的ROS濃度也有明顯的升高。為了進一步探究Ca2+的來源及其是否與ROS的變化有直接關(guān)系，我們分別使用了細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道抑制劑和細胞外Ca2+的螯合劑，發(fā)現(xiàn)J7

10、74細胞的Ca2+來源于細胞外，而RAW細胞的Ca2+來源于細胞內(nèi)。Ca2+被阻斷后，使得細胞內(nèi)ROS降低，最終引起細胞死亡的減少。
　　7.神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521激活溶酶體上組織蛋白酶B和D的信號通路，引起J774和RAW細胞死亡。采用組織蛋白酶B和D的抑制劑CA-074me和PA分別單獨和聯(lián)合使用處理的J774和RAW細胞后，加入LCL521作用。我們發(fā)現(xiàn)單獨使用其中任何一種抑制劑后并沒有逆轉(zhuǎn)LCL521引起的J774和R

11、AW細胞死亡，而這兩個抑制劑聯(lián)合使用時，逆轉(zhuǎn)了LCL521誘導(dǎo)的J774和RAW細胞死亡。這表明了神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521誘導(dǎo)的J774和RAW細胞死亡基于組織蛋白酶B和D信號通路。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521能有效誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞的死亡，并闡明了神經(jīng)酰胺類似物L(fēng)CL521在腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞作用中的分子機制。首次揭示了LCL521可以作為一種腫瘤相關(guān)的免疫抑制細胞的抑制劑，揭示了神經(jīng)酰胺類似