多種途徑誘生抑制性樹突狀細(xì)胞及其產(chǎn)生免疫抑制的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:CD80/CD86基因RNA干擾慢病毒載體誘生抑制性樹突狀細(xì)胞及其產(chǎn)生免疫抑制的研究
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在研究經(jīng)RNA干擾后，受者來(lái)源的抑制性樹突狀細(xì)胞(Dentriticcell，DC)在間接識(shí)別通路中產(chǎn)生免疫抑制活性的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:在受者C3H小鼠骨髓來(lái)源DC培養(yǎng)過(guò)程中，加入供者C57BL/6小鼠脾臟來(lái)源的抗原，通過(guò)CD80/CD86基因RNA干擾慢病毒感染負(fù)載供者抗原的受者DC。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)其

2、表面分子CD80和CD86的表達(dá)情況。并將該DC與C3H小鼠脾臟T細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte reaction，MLR)，檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)MLR上清液中的細(xì)胞因子IL-2、 IL-4、 IL-10及干擾素γ(Interferon-γ，INF-γ)的表達(dá)水平。通過(guò)Annexin V/CD3雙染色法檢測(cè)間接識(shí)別通路中T細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:相較對(duì)照組及空白組而言，CD8

3、0/CD86基因RNA干擾慢病毒感染組可明顯抑制DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)(P＜0.05)，并可以得到穩(wěn)定的抑制性DC。在MLR中，使用慢病毒處理受者DC能夠有效減弱對(duì)受者T細(xì)胞增殖的刺激作用。ELISA結(jié)果提示，培養(yǎng)上清中Th1細(xì)胞因子(IL-2和INF-γ)的含量明顯減少，而Th2細(xì)胞因子(IL-10)的含量顯著增高(P＜0.05)，IL-4表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）。并且發(fā)現(xiàn)抑制性DC可以顯著誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡

4、(P＜0.05)。
　　結(jié)論:慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾方法可以有效誘導(dǎo)CD80及CD86低表達(dá)的抑制性DC的生成。這種抑制性DC可以通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡的方式產(chǎn)生重要的免疫抑制活性。
　　第二部分:肝星狀細(xì)胞誘生抑制性樹突狀細(xì)胞及其產(chǎn)生免疫抑制的研究
　　目的:研究INF-γ促進(jìn)肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)表達(dá)B7-H1及其相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步研究HSC誘生抑制性DC并產(chǎn)生免疫抑制的

5、相關(guān)機(jī)制。
　　方法:在INF-γ活化C57BL/6小鼠HSC的過(guò)程中，我們將不同濃度的INF-γ作用于HSC，將恒定濃度的INF-γ與HSC作用0.5～48hrs。同時(shí)，利用INF-γ刺激INF-γ R1基因敲除及Stat1基因敲除小鼠的HSC。在此HSC活化過(guò)程中，還加入蛋白合成抑制劑(CHX)、RNA合成抑制劑(ActD)及信號(hào)通路抑制劑(U0126、SP600125和LY294002)，分別利用流式細(xì)胞儀及RT-PCR檢測(cè)

6、INF-γ促進(jìn)HSC表達(dá)B7-H1情況。通過(guò)Western blot檢測(cè)HSC中ERK1/2磷酸化情況。在C57BL/6小鼠骨髓來(lái)源DC培養(yǎng)過(guò)程中，加入活化的C57BL/6小鼠HSC。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DC表面分子CD80和CD86的表達(dá)情況。將該DC與BALB/c小鼠脾臟T細(xì)胞進(jìn)行MLR，檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。通過(guò)Annexin V/CD3雙染色法檢測(cè)MLR中T細(xì)胞凋亡的情況。
　　結(jié)果:經(jīng)INF-γ活化后，HSC表達(dá)B7-H1

7、顯著增加，且和INF-γ活化時(shí)間及濃度成正相關(guān)。INF-γ R1及Stat1基因敲除小鼠來(lái)源的HSC經(jīng)INF-γ活化后幾乎不表達(dá)B7-H1。ActD可以阻斷B7-H1 mRNA的合成，而CHX對(duì)B7-H1 mRNA的合成無(wú)影響。阻斷PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002對(duì)INF-γ活化HSC促進(jìn)B7-H1的表達(dá)無(wú)影響，而阻斷MEK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126可以顯著抑制B7-H1的表達(dá)。阻斷JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125可輕度減

8、少B7-H1的表達(dá)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)INF-γ活化的HSCs中ERK1/2發(fā)生磷酸化。激活后的HSC可以抑制DC表面分子CD80和CD86的表達(dá)。在MLR中，經(jīng)活化的HSC處理的DC能夠有效減弱對(duì)T細(xì)胞增殖的刺激作用。并且發(fā)現(xiàn)這些抑制性DC可以顯著誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:INF-γ通過(guò)MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)HSC高表達(dá)B7-H1。經(jīng)INF-γ活化的HSC可誘導(dǎo)抑制性DC生成，且此抑制性DC可通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)