FAT10調(diào)控survivin泛素化降解在膀胱癌增殖中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景和目的：膀胱癌（BC）是我國最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均占泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS)是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的一個重要途徑，F(xiàn)AT10是唯一能直接介導(dǎo)蛋白酶體降解途徑的類泛素蛋白，在調(diào)控細胞生物學(xué)功能方面發(fā)揮重要作用。Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族（IAPs）的成員，具有抑制細胞凋亡、促進細胞有絲分裂、調(diào)節(jié)細胞周期及增加細胞增殖的能力。
　　本研究主要探討膀胱癌組織及膀胱癌細胞中FAT10

2、和survivin的表達，分析兩者表達水平之間的關(guān)系及其臨床意義；研究FAT10通過調(diào)控survivin的表達對膀胱癌細胞增殖的影響及其具體機制。
　　方法：
　　1、選取隨訪5年以上資料完整的膀胱癌患者133例，免疫組化檢測FAT10和survivin在膀胱癌組織石蠟塊中的表達情況，分析FAT10和survivin表達的相關(guān)性、并分析其與患者的臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系。
　　2、收集50例膀胱癌患者的膀胱癌組織及癌旁

3、組織，通過熒光定量PCR、Western blot檢測膀胱癌組織和癌旁組織中FAT10和survivin的表達情況，并分析兩者表達是否存在相關(guān)性。
　　3、通過熒光定量PCR和Western blot檢測膀胱癌細胞T24、J82、5637、UM-UC-3及正常細胞株人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1中FAT10和survivin的mRNA和蛋白表達情況。
　　4、構(gòu)建了4個shFAT10干擾質(zhì)粒，并將我們構(gòu)建的4干擾質(zhì)粒

4、轉(zhuǎn)染至膀胱癌細胞，利用熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染48h后FAT10的表達變化，篩選出shFAT10最佳干擾質(zhì)粒；將篩選出的最佳shFAT10干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膀胱癌5637細胞中，運用Western blot檢測轉(zhuǎn)染48h后細胞中FAT10和survivin蛋白表達變化，運用EdU實驗觀察干擾FAT10后膀胱癌細胞增殖能力的變化；將過表達FAT10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到膀胱癌UM-UC-3細胞中，運用Western blot檢測轉(zhuǎn)

5、染48h后細胞中FAT10和survivin蛋白表達變化，運用EdU實驗觀察過表達FAT10后膀胱癌細胞增殖能力的變化；利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFAT10的膀胱癌細胞株建立人膀胱癌裸鼠皮下瘤模型，觀察裸鼠腫瘤的生長情況。
　　5、構(gòu)建了4個shsurvivin干擾質(zhì)粒，并將我們構(gòu)建的4個干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膀胱癌細胞，利用熒光定量PCR和Western blot檢測轉(zhuǎn)染48h后survivin蛋白和mRNA的表達變化,篩選出shsurvivin

6、最佳干擾質(zhì)粒；在膀胱癌細胞中降低FAT10的同時增加survivin的表達及在膀胱癌細胞中增加FAT10的同時干擾survivin的表達，利用EdU實驗觀察膀胱癌細胞增殖能力的變化。
　　6、利用免疫共沉淀、激光共聚焦及體外泛素化實驗等方法明確FAT10通過調(diào)控survivin的泛素化降解穩(wěn)定survivin表達的具體機制。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化顯示133例膀胱癌組織中FAT10的陽性率為52.6％，Survi

7、vin的陽性率為56.4%，且兩者的表達呈正相關(guān)；熒光定量PCR及Western blot檢測50例膀胱癌組織及癌旁組織中FAT10及survivin的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌組織中FAT10和survivin mRNA及蛋白的表達明顯高于癌旁組織，通過散點圖分析發(fā)現(xiàn)FAT10與survivin呈正相關(guān)；通過熒光定量PCR和Western blot檢測四株膀胱癌細胞和正常細胞株人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1中FAT10和survivin

8、的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有膀胱癌細胞株中的FAT10和 survivin的表達明顯高于正常細胞株人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1，且其表達趨勢較一致；FAT10和survivin的表達與患者的腫瘤分期有關(guān)，F(xiàn)AT10陽性表達組和survivin陽性表達組患者的總生存期及無疾病生存期5年生存率低于陰性表達組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；將患者FAT10和survivin的表達分為四類：FAT10(-)survivin(-)，F(xiàn)AT10(

9、+)survivin(-)，F(xiàn)AT10(-)survivin(+)，F(xiàn)AT10(+)survivin(+)，結(jié)果顯示FAT10(+)survivin(+)組對應(yīng)的平均生存時間最短；多因素Cox回歸分析顯示腫瘤分級為影響預(yù)后獨立的影響因素。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shFAT10質(zhì)粒的膀胱癌細胞5637中，F(xiàn)AT10蛋白表達明顯下降，同時survivin蛋白的表達也隨之減少，EdU實驗發(fā)現(xiàn)膀胱癌細胞5637中 shFAT10組的增殖能力比s

10、hNC組明顯降低；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達FAT10質(zhì)粒的膀胱癌細胞UM-UC-3中， FAT10蛋白表達明顯升高，同時survivin蛋白的表達也隨之增加，EdU實驗發(fā)現(xiàn)過表達FAT10可以明顯增加UM-UC-3細胞的增殖能力；利用人膀胱癌裸鼠皮下腫瘤模型發(fā)現(xiàn)shFAT10組的裸鼠成瘤體積明顯小于shNC組，瘤體的重量也明顯小于空載質(zhì)粒對照組。
　　3、轉(zhuǎn)染 shFAT10至5637細胞后發(fā)現(xiàn) survivin表達下降，而轉(zhuǎn)染GV141-

11、Survivin至穩(wěn)定干擾FAT10的5637細胞中可以恢復(fù)survivin的表達，增殖能力明顯升高；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）myc-His-FAT10至UM-UC-3細胞后，Survivin表達升高，而轉(zhuǎn)染shsurvivin至穩(wěn)定高表達FAT10的UM-UC-3細胞中發(fā)現(xiàn)survivin的表達下降，且增殖能力明顯下降。表明survivin是FAT10調(diào)節(jié)膀胱癌增殖的關(guān)鍵效應(yīng)分子。
　　4、免疫共沉淀及激光共聚焦發(fā)現(xiàn)survi