奶牛乳腺上皮細胞系的建立.pdf

1、乳腺上皮細胞是特化的具有分泌性的功能細胞，是乳腺行使泌乳功能的細胞基礎，亦是研究泌乳啟動、功能維持、退化等生理過程中內(nèi)外細胞因子調(diào)節(jié)、信號傳導、功能基因的表達以及乳腺腫瘤的形成、癌變必不可缺少的實驗材料?，F(xiàn)有的研究顯示反芻動物與人類、嚙齒類動物泌乳調(diào)控機制存在很大的差異，并且相對于其它種類動物而言，反芻動物的乳腺調(diào)控機理還未充分證明，主要原因是泌乳量較大的奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)較為困難。 體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞在乳腺生長發(fā)育

2、和泌乳機制的研究及乳腺生物反應器的應用等方面具有重要作用。目前雖然培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞已有一些報道，但往往未成功地建立起奶牛乳腺上皮細胞系，不適合作為研究泌乳機制及檢測乳腺表達載體的細胞模型。奶牛乳腺上皮細胞系的建立可為轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)、泌乳量提高等的研究提供良好的動物體外模型，具有泌乳功能的乳腺上皮細胞系亦可為乳腺發(fā)育學、乳腺病理學、泌乳生物工程學研究的細胞模型，因此，有必要對奶牛乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)技術和細胞系建立技術，激素與乳腺

3、上皮細胞分泌功能的關系等方面進行深入研究。 本研究選取屠宰場屠宰的泌乳后期的健康荷斯坦奶牛乳腺組織作為實驗材料，利用組織塊接種法成功地獲得了奶牛乳腺上皮細胞，并利用細胞角蛋白18的免疫熒光染色對乳腺上皮細胞進行了鑒定，通過對細胞接種存活率、群體倍增時間、生長曲線、形態(tài)學等生物學性狀的檢測，建立并鑒定了正常培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞系。此外，通過HPLC法對奶牛乳腺上皮細胞中乳糖和酪蛋白進行了測定，反映了激素對奶牛乳腺上皮細胞泌乳功能

4、的影響，從而為奶牛乳腺上皮細胞生物反應器模型的建立和泌乳機制的研究奠定了良好的基礎。 實驗結果表明，本研究獲得了純化的奶牛乳腺上皮細胞，建立并鑒定了奶牛乳腺上皮細胞系。通過細胞傳代，反復凍存和復蘇，實現(xiàn)了細胞系的長期保存，獲得了大量的乳腺上皮細胞。奶牛乳腺上皮細胞在添加表皮生長因子培養(yǎng)液中，生長增殖性狀良好，細胞傳到20代以上仍保持旺盛的增殖活力。胰島素培養(yǎng)的細胞中酪蛋白變化不大，而催乳素和孕酮的細胞酪蛋白有明顯的升高；對三種激

5、素作用下細胞培養(yǎng)液中酪蛋白在不同時間點含量變化進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)均明顯升高，在24小時內(nèi)，三種激素升高均最明顯；激素對細胞乳糖作用的HPLC結果發(fā)現(xiàn)，胰島素對細胞中乳糖的影響不大，而催乳素和孕酮對細胞中的乳糖有明顯的升高作用；對三種激素的培養(yǎng)液在不同時間點乳糖含量進行了研究發(fā)現(xiàn)，胰島素的培養(yǎng)液中乳糖濃度始終很高，但沒有什么變化，而催乳素和孕酮的培養(yǎng)液在各個時間點卻沒有什么明顯的變化，含量較低。同時對三種激素在不同時間點對細胞活力影響的