甜葉菊品系“1096”離體培養(yǎng)及其UGT76G1酶基因的克隆.pdf

1、我國甜葉菊品種是80年代初開始引種的，由于該植物自交不育異花授粉，幾代雜合之后植株良莠不齊，需要篩選新的優(yōu)良品種，同時需要改進種植方式。采用組織培養(yǎng)技術不僅能保持品種的優(yōu)良特性，還可不受外界條件的影響周年繁殖，在較短時間內(nèi)即可繁育出大批種苗；利用組織培養(yǎng)技術還將推動甜葉菊的遺傳改良，彌補甜葉菊傳統(tǒng)育種的不足。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧食組織（WHO/FAO）所屬的食品添加劑專家委員會（JECFA）在第63次日內(nèi)瓦會議上認可了甜葉菊提取物使用

2、的試行案。即人的體重每公斤每天可攝取0 ～2mg甜葉菊糖苷，同時規(guī)定糖苷的純度應該大于95％，這就要求我們改進生產(chǎn)工藝降低耗水量，增加純度，特別是生產(chǎn)口味純正的RebaudiosideA（RA）含量高的產(chǎn)品，或培育出高RA含量的甜葉菊新品種。
　　 本試驗在前人研究的基礎上，建立了本實驗室采用改良DNS等方法篩選出的，高糖苷含量品系“1096”的組培快繁體系，為該品系在生產(chǎn)上的推廣應用奠定基礎；并探討了不同濃度蔗糖和甘露醇對其離

3、體保存的影響，為控制增殖繼代次數(shù)及甜葉菊優(yōu)良種質的離體保存提供理論基礎；采用TD-PCR法克隆了控制由Steviolbioside 和Stevioside 到RebaudiosideA合成的UGT76G1酶的基因。主要研究結果如下：
　　 1.采用甜葉菊品系“1096”為材料，研究了不同外植體、不同激素種類和配比對愈傷組織誘導、不定芽分化，生根及移栽的影響。結果表明：以莖尖為外植體愈傷組織和不定芽誘導率均最高；其次是帶腋芽莖段；

4、再次為葉片。無腋芽莖段和無菌根均能誘導出愈傷組織，但不能誘導成芽。莖尖不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L；葉片不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+IAA1.0mg/L；帶腋芽莖段不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L。不定芽繼代增殖培養(yǎng)采用MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L；在1/4MS+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L+1g/L活性炭的培養(yǎng)基上誘導生根，生根

5、率可達100％，生根苗移栽后成活率達95％。
　　 2.甜葉菊種質離體培養(yǎng)保存具有一定的可行性。1/4MS+10g/L甘露醇更適合于甜葉菊品系“1096”的離體保存，試管苗經(jīng)過再生培養(yǎng)，均能恢復原有的形態(tài)，其葉型、株型等形態(tài)特征與對照沒有差別。
　　 3.利用反轉錄與TD-PCR技術克隆了甜葉菊品系“1096”UGT76G1酶的基因，并利用部分生物信息學軟件對克隆出的基因和推導的氨基酸序列進行了分析，為今后利用生物工程手