FADS2基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能的初步探究.pdf

1、研究背景和目的：
　　食管癌是人類常見的消化道惡性腫瘤之一，死亡率在所有腫瘤中排名第四[1]，病理類型分為鱗癌和腺癌，在我國(guó)食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是最主要的病理類型，其發(fā)病率具有明顯的地區(qū)差異和家族聚集現(xiàn)象，其高發(fā)區(qū)位于東亞以及中國(guó)東部地區(qū)，特別是河南的林州、安陽(yáng)、輝縣和大別山區(qū)等地。當(dāng)前的腫瘤分子生物學(xué)研究資料表明，環(huán)境、遺傳和精神心理等因素通過(guò)協(xié)同或序貫

2、的方式引起DNA損傷，使抑癌基因失活或者使原癌基因激活，加上凋亡調(diào)節(jié)基因或者DNA修復(fù)基因的異常改變，促使正常的食管粘膜經(jīng)過(guò)一個(gè)多因素、多基因、多階段的惡性演化過(guò)程，由此發(fā)展為食管癌[2]，據(jù)此，從DNA修復(fù)基因、原癌基因、抑癌基因、代謝酶基因的遺傳多態(tài)性入手研究易感基因及腫瘤標(biāo)志物可以為食管癌的早期診斷、治療及預(yù)后提供更多的理論依據(jù)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中脂肪酸去飽和酶基因2(Fatty Acid Desaturase2,FA

3、DS2)表達(dá)水平增高，促進(jìn)亞油酸（linoleic acid,LA）轉(zhuǎn)化成二十碳四烯酸（arachidonic acid,AA），同時(shí)其代謝產(chǎn)物前列腺素E2（Prostagland E2,PGE2)增多，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的促進(jìn)的作用[4]，在食管鱗癌中該基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，其機(jī)制尚不清楚。本文通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)FADS2基因在ESCC及癌旁正常黏膜組織中mRNA及蛋白的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系；通過(guò)慢

4、病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)FADS2的細(xì)胞克隆，進(jìn)行體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)初步探討其生物學(xué)功能。
　　研究方法：
　　1.臨床標(biāo)本的收集
　　從河南省林州市人民醫(yī)院收集手術(shù)切除的ESCC新鮮組織標(biāo)本，每例標(biāo)本包含食管鱗癌組織及癌旁組織，共70對(duì)，儲(chǔ)存于液氮中，用于提取組織RNA，檢測(cè)FADS2 mRNA的表達(dá)。另外，本課題組調(diào)取了河南省林州市人民醫(yī)院299例ESCC根治

5、切除術(shù)的石蠟包埋組織樣本，整理臨床病理和隨訪資料，制作ESCC的組織芯片。
　　2.方法
　　通過(guò)QPCR方法檢測(cè)FADS2 mRNA在70例ESCC及癌旁相對(duì)正常粘膜組織標(biāo)本中的表達(dá)情況；通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)FADS2蛋白在299對(duì)ESCC組織芯片中的表達(dá)水平，并分析FADS2的表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。
　　通過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)將FADS2表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞株KYSE30和KYSE5

6、10中，篩選出穩(wěn)定表達(dá)FADS2的細(xì)胞，并用QPCR、Western blot鑒定。
　　通過(guò)體外的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)研究FADS2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、克隆形成、遷移及侵襲能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.QPCR方法檢測(cè)FADS2在食ESCC及其相對(duì)應(yīng)的癌旁正常粘膜組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示FADS2 mRNA在ESCC組織中呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，而在癌旁組織中呈現(xiàn)相對(duì)低表

7、達(dá)現(xiàn)象，且在 ESCC組織和癌旁組織中的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　2.IHC結(jié)果提示在有效的208例檢測(cè)樣本中，在癌組織中112例FADS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(53.8％)，96例FADS2蛋白陰性表達(dá)(46.2%)；208例相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中，63例FADS2蛋白陽(yáng)性表達(dá)(30.3%)，145例FADS2蛋白陰性表達(dá)(69.7%)，F(xiàn)ADS2的陽(yáng)性表達(dá)率之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

8、發(fā)現(xiàn)FADS2高表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)（P<0.05），但與患者年齡、性別、腫瘤分化程度及浸潤(rùn)均未發(fā)現(xiàn)有明顯相關(guān)性(P>0.05)。Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，F(xiàn)ADS2高表達(dá)組（n=79）與正常表達(dá)組（n=129）的生存曲線有顯著差異，F(xiàn)ADS2高表達(dá)患者的中位生存時(shí)間18個(gè)月，F(xiàn)ADS2正常表達(dá)患者的中位生存時(shí)間27個(gè)月，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.通過(guò)體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)