HNF1α翻譯后修飾的分子機(jī)制及生物學(xué)意義.pdf

1、肝細(xì)胞核因子1α(HNF1α)作為肝臟中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，以復(fù)合體形式參與調(diào)控多種肝臟特異基因的表達(dá)，并涉及蛋白質(zhì)合成、物質(zhì)代謝、損傷修復(fù)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。同時(shí)HNF1α也是維持胰腺功能的重要分子，調(diào)控胰島素、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等分子的表達(dá)。在腸和腎中，HNF1α也發(fā)揮著調(diào)控發(fā)育和物質(zhì)吸收的重要作用。在糖代謝中，HNF1α更是扮演著“中心分子”的作用。HNF1α的突變會(huì)引發(fā)Ⅲ型青少年發(fā)病的成人糖尿病，也就是臨床上所說(shuō)的MODY3，這是一

2、種由單基因突變所導(dǎo)致的負(fù)顯性突變疾病，臨床上表現(xiàn)為25歲前發(fā)病，胰島素分泌不足，血糖嚴(yán)重升高等癥狀，由于患者HNF1α基因突變的晚期糖尿病并發(fā)癥的頻率高，早期診斷與適當(dāng)?shù)闹委熆梢詼p少或延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。因此研究HNF1α調(diào)控機(jī)制和功能有著重要的意義。
　　在研究中我們通過(guò)IP-MS發(fā)現(xiàn)，HNF1α是一個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)。并且我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)，Ser249位。接下來(lái)我們通過(guò)體外磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論內(nèi)源或者外源ATM蛋

3、白激酶都可以磷酸化HNF1α的Ser249位點(diǎn)。當(dāng)輻射處理引發(fā)DNA損傷活化ATM激酶活性時(shí)，HNF1α的磷酸化水平顯著提高。我們發(fā)現(xiàn)使用ATM特異抑制劑KU55933處理細(xì)胞后，HNF1α磷酸化水平下降。IP-MS檢測(cè)結(jié)果也顯示抑制劑處理組249位磷酸化消失。為了進(jìn)一步研究Ser249位點(diǎn)突變對(duì)HNF1α功能和調(diào)控機(jī)制的影響，我們構(gòu)建了HNF1α-S249A突變體，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野

4、生型相比，HNF1α-S249A突變體轉(zhuǎn)錄活性和下游靶基因表達(dá)均顯著下調(diào)。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，HNF1αSer249位點(diǎn)的磷酸化與之前已報(bào)道的Ser247位點(diǎn)的磷酸化相互獨(dú)立互不影響，競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，HNF1α-S249A突變體不具有負(fù)顯性抑制功能。我們通過(guò)EMSA和CHIP實(shí)驗(yàn)分別從體內(nèi)和體外兩條途徑證明，與野生型HNF1α相比，HNF1α-S249A突變體的DNA結(jié)合能力顯著下調(diào)，間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)證明，HNF1αSer249位點(diǎn)突變

5、不影響HNF1α的亞細(xì)胞定位。同時(shí)我們也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HNF1α-S249A突變體會(huì)引起糖代謝功能異常，提示了ATM調(diào)控糖代謝過(guò)程中新的機(jī)制發(fā)現(xiàn)。我們不僅從分子水平探索了HNF1α磷酸化修飾的分子機(jī)制和生物學(xué)意義，而且通過(guò)HNF1α-WT和HNF1α-S249A轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)來(lái)研究HNF1α對(duì)于生理功能的意義。我們以轉(zhuǎn)基因野生型HNF1α作為對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，HNF1α-S249A轉(zhuǎn)基因小鼠并未表現(xiàn)出明顯的糖尿病或者其他糖代謝異常表型，

6、體重變化、葡萄糖耐受、胰島素耐受都未出現(xiàn)異常，而丙酮酸耐受下降，說(shuō)明，HNF1αSer249位點(diǎn)突變降低了HNF1α-S249A轉(zhuǎn)基因小鼠糖異生能力，此外，我們還對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠血清腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因HNF1α-WT小鼠在胰腺腫瘤標(biāo)志物CA242、肝癌腫瘤標(biāo)志物AFP、乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA153顯著下調(diào)，這些數(shù)據(jù)也許提示了HNF1α在腫瘤發(fā)生中的一些作用。
　　除了磷酸化修飾之外，我們還通過(guò)IP-MS鑒定到了HNF1α的乙?；?/p>

7、位點(diǎn)Lys117位。且臨床上有報(bào)道在MODY3患者中檢測(cè)到117位突變，我們推測(cè)該位點(diǎn)的乙?；揎棇?duì)HNF1α的功能十分重要。首先我們通過(guò)Lys乙酰化抗體免疫印跡發(fā)現(xiàn)，HNF1α是一個(gè)乙?；鞍?，共轉(zhuǎn)染乙?；竝300和使用去乙酰酶抑制劑TSA/Nam可以促進(jìn)HNF1α乙?；囸I和乙?；竝300抑制劑處理會(huì)降低HNF1α乙酰化水平。同時(shí)，為了進(jìn)一步研究HNF1αLys117位點(diǎn)乙?；瘜?duì)HNF1α的功能和調(diào)控機(jī)制影響，我們構(gòu)建了Ly

8、s117位的點(diǎn)突變，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示，Lys117位點(diǎn)突變下調(diào)了HNF1α的轉(zhuǎn)錄活性。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，HNF1α-Lys117位點(diǎn)突變體不具有負(fù)顯性抑制功能。接下來(lái)，我們通過(guò)EMSA和CHIP實(shí)驗(yàn)分別從體內(nèi)和體外兩條途徑證明，與野生型HNF1α相比，HNF1αLys117位突變體的DNA結(jié)合能力顯著下調(diào)，間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)證明，HNF1αLys117位點(diǎn)突變不影響HNF1α的亞細(xì)胞定位。同時(shí)我

9、們也在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HNF1αLys117位點(diǎn)突變會(huì)引起糖代謝功能異常。我們通過(guò)免疫共沉淀相互作用和熒光共振(FRET)實(shí)驗(yàn)以及生物信息學(xué)分子模建發(fā)現(xiàn)，HNF1αLys117位點(diǎn)突變或者p300抑制劑處理會(huì)減弱其二聚體穩(wěn)定性，從而降低了HNF1α的DNA結(jié)合能力，下調(diào)了HNF1α的轉(zhuǎn)錄活性和下游靶基因表達(dá)。
　　縱觀整個(gè)研究過(guò)程，我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)了HNF1α的一個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)和調(diào)控它的上游激酶ATM，為ATM激酶參與調(diào)控糖