高原適應表觀遺傳學甲基化研究技術MS-RDA的優(yōu)化與應用.pdf

1、背景:內地人進入高原往往會產生嚴重的高原反應。而在那里世代居住的少數民族已經由長期自然選擇適應了高原環(huán)境，這種適應能力是可以遺傳的。目前關于高原適應的研究多集中在以序列改變?yōu)榛A的基因多態(tài)性引起的多等位基因方面，無論是習服理論還是需要長期自然選擇的基因多態(tài)性理論都不能解釋這些在胚胎期和嬰幼兒期出現的高原適應性改變，近年來表觀遺傳學的新理論、新方法的出現為解釋發(fā)育性適應提供了可能，基因的表觀遺傳學改變也可遺傳，且已被證明同樣是基因調節(jié)的重

2、要方式。但胚胎期或者發(fā)育期高原低氧是否能夠引起表觀遺傳的改變，導致機體對高原的長期適應目前國內外未見相關報道。有研究發(fā)現缺失DNA甲基化酶的一種結核桿菌比其他組死亡速度加快，即DNA甲基化酶在低氧適應過程中可能起到重要的作用，而DNA甲基化在高原適應的表觀遺傳學研究中的意義尚未見報道，我們決定從甲基化差異入手探尋高原適應在基因水平上新的機制，這在高原適應的表觀遺傳學研究中尚屬首次。
　　方法:1.MS-RDA法優(yōu)化:甲基化敏感的代

3、表性差式分析(Methylation-SensitiveRepresentational Difference Analysis，MS-RDA)是通過基因組消減雜交方法來篩選不同來源的兩個基因組中差異甲基化片段的重要方法，經典MS-RDA法經過酶切和回收后需要更換好幾次DNA接頭，且步驟繁瑣，這樣降低實驗的效率因而需要的樣本量比較大（每次實驗需10μg）。為此，我們根據一種先分別運用含dUTP的dNTP以及含dTTP的dNTP混合物進行

4、PCR擴增，將擴增子雜交后再使用UDG酶和S1核酸酶切割雙鏈驅趕子DNA以及驅趕子和檢測子DNA雜交體的方法對傳統(tǒng)的MS-RDA進行了改良，大大簡化實驗程序，降低了樣本需求量并提高了獲得差異甲基化DNA片段的機率。在進行正式實驗之前，首先驗證了改良的MS-RDA方法的特異性，將完全相同的人臍靜脈內皮細胞基因組DNA分別作為檢測子和驅趕子進行實驗排除出現假陽性的可能;為判斷改良方法的靈敏性，在兩份相同的臍靜脈內皮細胞的基因組DNA樣品中分

5、別加入線性化的未用HpaⅡ甲基化酶處理（作為檢測子DNA）以及經HpaⅡ甲基化酶處理的pUC19質粒（作為驅趕子DNA），隨后進行后續(xù)實驗并將得到的差異片段連接至pcDNA3-T載體，轉化DH5α感受態(tài)細胞經LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取陽性克隆，進行序列分析。
　　2.分子克隆方法優(yōu)化:將5'和3'端含有XcmⅠ識別序列的人組蛋白H4 cDNA定向克隆至pCDNA3.0表達載體中，在用XcmⅠ酶切得到基于pCDNA3.0載體骨架的T載

6、體，為檢測T載體的可用性，分別將長度為312bp和1329bp的cDNA片段與其連接并將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)轉化子，通過菌液PCR和瓊脂糖凝膠電泳估算轉化子的陽性率。
　　3.世居高原人群特征性基因甲基化片段篩選:在證實了改良的MS-RDA方法的特異性和靈敏性之后，我們分別提取了五個世居高原的柯爾克孜族人血液的基因組DNA以及五個平原的柯爾克孜族人血液的基因組DNA，以高原柯族人的血液基因組DNA作為驅趕子

7、(Driver)，以平原柯族人的血液基因組DNA作為檢測子(Tester)，用改進后的MS-RDA法進行實驗，將得到差異片段切膠回收后按照優(yōu)化過的連接方案連接我們自己構建的pcDNA3-T載體并轉化測序，將測序結果進行BLAST分析及人類基因組定位分析。
　　結果:1.改良MS-RDA方法:對改良的MS-RDA方法特異性分析表明，兩組相同DNA進行酶切、擴增、雜交、消化、擴增等步驟后沒有得到差異化條帶，表明本方法具有很好的特異性;

8、在相同的基因組中分別加入甲基化差異的DNA再運用改良的MS-RDA方法實驗，結果得到了特異的差異條帶，對條帶進行序列分析，結果完全符合預期，說明經改良后的MS-RDA方法具有很好的靈敏性。
　　2.基于XcmⅠ識別序列的T載體的構建及其與PCR片段連接的條件優(yōu)化經XcmⅠ酶切后的T載體能高效地與目的DNA片段連接;除T載體本身質量外，擴增DNA片段所用引物的磷酸化與否也是影響克隆效率的重要因素之一;對較大的插入片段而言，經PCR擴

9、增、純化后再用Taq DNA聚合酶和dATP處理也能夠顯著增加連接效率。
　　3.運用改良的MS-RDA法對五對高原和平原的柯爾克孜族血液基因組DNA樣品進行實驗，共獲得差異片段11條，其中5條編碼序列被GENBANK收錄，均位于線粒體上，片段兩端位點確實具有HpaⅡ酶切位點，其中2條為編碼COX1片段，3條為編碼NADH還原酶2、4和5的序列。
　　結論:建立了改良的MS-RDA方法，該方法具有很好的特異性和靈敏性，該方法

10、是篩選差異甲基化基因的一種比較好的方法;基于XcmⅠ識別序列的T載體的構建及其與PCR片段連接的條件優(yōu)化克服了對藍白篩選或插入自殺基因等條件的限制，可為常規(guī)的實驗室容易的制備T載體并進行高效地連接提供了高效的途徑;運用改良的MS-RDA方法發(fā)現了在世居高原和平原柯爾克孜族人群血液基因中甲基化水平差異的DNA片段。對得到的11條差異的DNA片段進行克隆、序列分析并BLAST分析后發(fā)現有五條被GenBank收錄的差異片段，其中兩條為在線粒體