Sorangium cellulosum So0157-2木聚糖酶的細胞分布及Xyn11C的異源表達、性質(zhì)研究.pdf

1、S cellulosum So0157-2中含豐富的木聚糖降解酶系，至少含有5個GH11家族的木聚糖酶，同時還具有GH8、GH10、GH43及GH52家族的木聚糖酶。實驗室前期克隆表達表征了Xyn11A和Xyn11B，結(jié)果顯示雖然同為11家族的木聚糖酶，Xyn11A為典型內(nèi)切酶，Xyn11B降解木聚糖僅產(chǎn)生木二糖，各具獨特的性質(zhì)。本研究進一步針對So0157-2中木聚糖酶基因xyn11C構(gòu)建了表達載體pET-30a(+)-xyn11C。

2、重組蛋白rXyn11C在E.coli BL21(DE3)中以可溶和包涵體兩種形式表達，但可溶表達的蛋白量很低。因此對包涵體蛋白進行了Ni-親和層析和透析復性，得到了電泳純且具有很高木聚糖酶活性的重組蛋白rXyn11C。
　　 rXyn11C專一地降解木聚糖底物，對山毛櫸木木聚糖表現(xiàn)出最高的酶活力。以山毛櫸木木聚糖為底物的Km值為4.030 mg/ml，Vmax值為0.533mmolmin-1mg-1;以樺木木聚糖為底物的Km值為

3、3.403 mg/ml，Vmax值為0.276mmolmin-1mg-1。rXyn11C的最適作用pH為7.0，在45℃反應(yīng)溫度下活性最高，在pH10.0 Tris-HCl緩沖液中孵育30min，殘留約50％活性，在45℃孵育30min殘留約40％活性，50℃處理30min，酶基本完全失活。在1mM的濃度下，Zn2+、Mn2+、Ag+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Co2+、pb2+、SDS對酶活有明顯的抑制作用;在10mM的濃度下，除

4、Li+、K+之外，大部分測定的金屬離子及化學試劑均能夠?qū)Xyn11C木聚糖酶活性產(chǎn)生不同程度的抑制，其中Cu2+、Fe3+、Hg2+離子能導致rXyn11C木聚糖酶活性的完全喪失;然而1mM和10mM的Tween20對酶活都具有明顯的促進作用。薄層層析(TLC)發(fā)現(xiàn)，rXyn11C對山毛櫸木木聚糖的降解產(chǎn)物為多種低聚寡糖。rXyn11C僅能夠降解木四糖以上的寡糖，并產(chǎn)生高于底物聚合度的寡糖組分，同時顯示出降解活性和糖基轉(zhuǎn)移酶的合成活性

5、。木三糖能促進rXyn11C對木四糖的糖基轉(zhuǎn)移作用，這種促進作用隨著作用時間的延長越加明顯。
　　 簡單無機鹽濾紙培養(yǎng)基是纖維堆囊菌分離純化和培養(yǎng)保存的常規(guī)營養(yǎng)基質(zhì)。本文研究了S.cellulosum So0157-2在簡單無機鹽加濾紙（結(jié)晶纖維素）之外的其他糖類物質(zhì)作為唯一碳源進行生長的能力。結(jié)果顯示出不同的利用能力，在以土豆淀粉、L-阿拉伯糖、糊精、葡萄糖、木聚糖等為唯一碳源時具有明顯的生長趨勢，而對木糖、羧甲基纖維素、殼聚

6、糖等糖類物質(zhì)的利用能力較弱。研究So0157-2以葡萄糖、木聚糖為唯一碳源的生長情況發(fā)現(xiàn)其在濃度為0.75％的CNST-G、CNST-X生長較好，在第1-2天達到最大生物量。
　　 細胞組分的空間分布可以通過細胞組分的分級分離并進行檢測的方法進行研究。本文選擇復雜培養(yǎng)基M26以及簡單培養(yǎng)基CNST-G和CNST-X培養(yǎng)So0157-2，收集濃縮培養(yǎng)液作為胞外游離組分，收集細胞并分離成膜組分和細胞內(nèi)可溶組分。對胞外游離組分、膜組分

7、和細胞內(nèi)可溶組分進行酶活測定、酶譜分析和部分酶組分的western bolt檢測。結(jié)果顯示三種培養(yǎng)基來源的胞外游離組分、膜組分和細胞內(nèi)可溶組分均具有可檢測的木聚糖酶酶活和CMC酶活。膜組分的木聚糖酶活性占總木聚糖酶酶活的50％以上，可能在So0157-2利用木聚糖過程中起著重要作用。木聚糖酶酶譜分析發(fā)現(xiàn)胞外游離組分具有木聚糖酶活性，說明液體培養(yǎng)的So0157-2可能分泌木聚糖酶至細胞外，但M26，CNST-X培養(yǎng)的So0157-2胞外游

8、離組分的木聚糖水解條帶明顯多于CNST-G;三種培養(yǎng)基培養(yǎng)的So0157-2的細胞內(nèi)可溶組分的木聚糖酶酶譜都得到3條位置相同的水解條帶，可能是相同木聚糖酶的作用結(jié)果;CNST-X培養(yǎng)的So0157-2膜組分的酶譜最上面一條水解帶對應(yīng)的蛋白大小大于230kDa，與M26和CNST-G培養(yǎng)的So0157-2的膜組分酶譜不同。這些差異可能與培養(yǎng)基中淀粉、木聚糖和葡萄糖對木聚糖酶的表達的誘導和阻遏作用有關(guān)。以CMC為底物的酶譜分析發(fā)現(xiàn)各個組分都

9、能形成多條水解條帶，對應(yīng)著多種CMC酶，其蛋白大小主要分布在25kDa-100 kDa之間，不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的So0157-2的組分的CMC酶酶譜有多處不同，表現(xiàn)在CMC酶的種類及相對含量上。利用抗-rXyn11A多克隆抗體進行的Western Blot在各組分中都雜交出多條條帶。在Xyn11A的理論分子量的位置，3種細胞內(nèi)可溶組分及CNST-G的胞外游離組分中有兩條雜交條帶。
　　 細胞組分的細胞空間分布還可以采用細胞原位定位的

10、方法。本文選取CNST-F平板培養(yǎng)的So0157-2細胞，用25％蔗糖質(zhì)壁分離處理后，包埋、固定后制備了超薄切片。利用抗-rXyn11A多克隆抗體，通過免疫膠體金標記、透射電鏡檢測研究Xyn11A的細胞定位情況，建立了在纖維堆囊菌中進行蛋白細胞原位定位的操作體系。透射電鏡結(jié)果顯示，陰性對照E.coli BL21(DE3)-pET-22b細胞及細胞外面均勻分布少量非特異性結(jié)合金顆粒;陽性對照E.coli BL21(DE3)-pET-22b