Arabidopsis thaliana BTR1蛋白的原核表達(dá)及理化性質(zhì)分析.pdf

1、BTR1蛋白是擬南芥中與番茄花葉病毒(ToMV)基因組RNA相結(jié)合的蛋白，能抑制此病毒的擴(kuò)增。BTR1由334個(gè)氨基酸殘基組成，其含有三個(gè)異構(gòu)核核糖核蛋白K同源RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(KH domain)，KH domain能有序列特異性的與單鏈核酸結(jié)合。BTR1基因產(chǎn)生兩個(gè)剪接變體mRNA，分別編碼不同蛋白產(chǎn)物BTR1L和BTR1S，擬南芥中主要表達(dá)的是BTR1S蛋白。BTR1S蛋白的mRNA在擬南芥的葉，莖及果實(shí)的組織中都可以表達(dá)。ToM

2、V的基因組RNA長度為6384nts，并且具有71nt的5'UTR（非翻譯區(qū)）和202nt的3'UTR。BTR1S優(yōu)先并直接結(jié)合ToMV基因組RNA的5'UTR。BTR1的敲除和過表達(dá)分別導(dǎo)致擬南芥葉中ToMV增殖的增加和減少，但是在原生質(zhì)體中，這種影響很難被檢測到。并且這種影響是特異性的。
　　目前為止，對于BTR1蛋白的研究報(bào)道非常少見，關(guān)于該蛋白的晶體結(jié)構(gòu)及功能機(jī)制并沒有報(bào)導(dǎo)，并且BTR1蛋白對ToMV擴(kuò)散的負(fù)面影響的基礎(chǔ)機(jī)

3、制也是未知的。本研究對Arabidopsis thaliana BTR1基因的原核表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，然后進(jìn)行原核表達(dá)，利用層析的方法純化得到了BTR1蛋白，并對其均一性、聚集狀態(tài)及與單鏈核酸的結(jié)合活性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究BTR1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能等提供了基本數(shù)據(jù)。主要獲得以下研究結(jié)果:
　　1.人工合成經(jīng)過優(yōu)化的編碼序列Arabidopsis thaliana BTR1基因，構(gòu)建pET-15b(BE-)SUMO-BTR1表達(dá)質(zhì)粒

4、，轉(zhuǎn)化到E.coli2566感受態(tài)中18℃誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni-NTA柱及Superdex200進(jìn)行蛋白純化，得到了純度大于95％的BTR1蛋白，其分子量約為34kD。
　　2.通過凝膠過濾層析和動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)(DLS)對BTR1蛋白的均一性及聚集狀態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)全面的分析。結(jié)果顯示，BTR1蛋白有很好的均一性，在溶液中聚集狀態(tài)可能為多聚體，而不是單體。
　　3.通過凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)(EMSA)分析BTR1蛋白與單鏈核酸的結(jié)合活性

5、，結(jié)果顯示BTR1具有單鏈DNA和RNA的結(jié)合活性，與雙鏈DNA和G4無法結(jié)合。
　　4.通過熒光各向異性技術(shù)進(jìn)一步測定BTR1蛋白與單鏈核酸的結(jié)合活性，結(jié)果顯示與EMSA所測定的結(jié)果相一致，BTR1能與單鏈DNA和RNA相結(jié)合。對于相同類型的ssDNA與ssRNA底物，隨著鏈的增長BTR1對其結(jié)合活性呈逐漸增強(qiáng)的趨勢。BTR1對于序列是隨機(jī)的ssDNA比序列中含有連續(xù)重復(fù)堿基的ssDNA的結(jié)合活性更強(qiáng)。BTR1與ssRNA的結(jié)合

6、活性要強(qiáng)于與ssDNA的結(jié)合活性。
　　5.假絲酵母Pif1解旋酶(Capif1)可以在撞擊端粒酶之后行使解旋酶功能，然后進(jìn)行第二輪的延伸，并且發(fā)現(xiàn)Capif1具有3'-5'外切活性。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)中18℃誘導(dǎo)表達(dá)，使用Ni-NTA親核柱、SP陽離子柱及Superdex200進(jìn)行蛋白純化，得到了純度大于95％的Capif1蛋白，其分子量約為79kD。
　　本研究成功構(gòu)建并表