AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵體系構(gòu)象變化及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的計算模擬研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的主要承載者，是存在最廣泛、最豐富的生物大分子。在生理條件下，不同的氨基酸序列能夠折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)，早在上世紀(jì)四十年代，人們就已經(jīng)利用X射線單晶衍射的方法得到了一些蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。由于X射線單晶衍射得到的結(jié)構(gòu)是靜止的，所以蛋白質(zhì)分子給人的最初的印象是單一的、剛性的。隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定技術(shù)的日益成熟，人們逐漸發(fā)現(xiàn)對于同一個蛋白質(zhì)分子在不同晶體環(huán)境中得到的結(jié)構(gòu)往往處于不同的構(gòu)象，而這些構(gòu)象之間具有大幅度的變化，逐漸

2、認(rèn)識到蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化對于其生物學(xué)功能的重要性。這種現(xiàn)象用物理學(xué)家的語言來描述就是蛋白質(zhì)分子作為一種軟物質(zhì)，是一個由不同構(gòu)象組成的龐大系綜，可以用多維勢能面較直觀的描述，勢能面可以給出每個構(gòu)象的相對分布情況（熱力學(xué)）和構(gòu)象之間轉(zhuǎn)換的能壘（動力學(xué)）。晶體結(jié)構(gòu)只是蛋白質(zhì)勢能面上的一個點，要全面理解蛋白質(zhì)的功能和揭示生理過程的分子機(jī)制，我們不但需要了解蛋白質(zhì)的靜態(tài)結(jié)構(gòu)，更需要了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔性和各構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)換，即其動態(tài)特性。因此需要在

3、傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中加入第四個維度，即時間，這樣就將結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系擴(kuò)展到結(jié)構(gòu)-動力學(xué)-功能關(guān)系的研究。
　　蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化在空間和時間尺度上分布很廣，從快速的局部原子振動、側(cè)鏈轉(zhuǎn)動到慢速的大幅度的結(jié)構(gòu)域的整體運(yùn)動、蛋白質(zhì)折疊、變構(gòu)效應(yīng)、蛋白質(zhì)變性。研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的實驗手段有很多，如X射線單晶衍射、核磁共振（NMR）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、圓二色光譜(CD)、紅外光譜、拉曼光譜、電子順磁共振等。和實驗手段相比

4、，計算機(jī)模擬方法在研究蛋白質(zhì)動力學(xué)方面具有獨特的優(yōu)勢。它可以在原子尺度上對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行詳細(xì)微觀研究，跟蹤體系中每一個原子隨時間的自然演化過程以預(yù)測其性質(zhì)，給出蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子內(nèi)部運(yùn)動的最詳實的結(jié)果，直接在原子尺度上提供蛋白質(zhì)分子和其他生物大分子的動態(tài)信息并且可以以此推測動態(tài)運(yùn)動與生物功能之間的關(guān)系。這些都是實驗中很難甚至無法達(dá)到的。目前由于計算機(jī)計算能力、并行效率以及計算精度的限制，對于μs～ms級的構(gòu)象變化是很難用普通的全原

5、子的分子動力學(xué)模擬的。為了克服這一困難，計算生物學(xué)家發(fā)展了多種方法和策略來簡化力場或施加外力以加速構(gòu)象變化的演化過程。
　　本論文中我們的研究體系是AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵，希望通過計算機(jī)模擬的方法研究其構(gòu)象變化的動力學(xué)，增強(qiáng)對其作用機(jī)理的認(rèn)識，揭示其作用過程的分子機(jī)理，為藥物的研制、疾病的治療提供更多的信息和理論基礎(chǔ)。
　　多重耐藥性是導(dǎo)致抗感染藥物治療和腫瘤化療失敗的重要原因之一，可以對結(jié)構(gòu)和功能上迥異的多種

6、藥物或?qū)ζ溆卸镜拇x產(chǎn)物同時表現(xiàn)出耐受性。多重耐藥性主要是由細(xì)菌或腫瘤細(xì)胞膜上多重耐藥泵產(chǎn)生的，廣泛存在于自然界中，在革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真核細(xì)胞中都可見到。已發(fā)現(xiàn)與多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的蛋白超家族主要有5個:ABC(ATP binding cassette)超家族、RND(resistance nodulation division)超家族、MF S(major facilitator superfamily)超家族、MAT

7、E(the multidrug and toxic-compound extrusion)超家族、SMR(smallmultidrug resistance)超家族。其中，RND蛋白在真核和原核細(xì)胞中都存在，是一種繼發(fā)性主動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由質(zhì)子順電化學(xué)梯度的跨膜運(yùn)動提供能量。目前RND蛋白中研究比較多、比較清楚的體系是來自于大腸桿菌的AcrB蛋白，是大腸桿菌產(chǎn)生多重耐藥性最重要的蛋白之一。
　　AcrB在發(fā)揮其生物功能時需要兩個幫手:

8、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC，這三個蛋白組合成一個轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物AcrAB-TolC。在這個AcrAB-TolC多重耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)體系中，AcrB位于細(xì)胞內(nèi)膜，其主要功能是通過質(zhì)子順電化學(xué)梯度的跨膜運(yùn)動（從細(xì)胞周質(zhì)到細(xì)胞質(zhì)）為整個體系提供能量，以及篩選由細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞周質(zhì)進(jìn)入的分子，將篩選出的底物分子傳遞給TolC; TolC位于細(xì)胞外膜，將底物分子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外;AcrA位于細(xì)胞周質(zhì)中，與AcrB，TolC都有相互作用，對于整個體系的

9、轉(zhuǎn)運(yùn)功能必不可少，但其具體作用機(jī)理尚不清楚。
　　通過X射線單晶衍射得到的三維結(jié)構(gòu)顯示AcrB以三聚體的形式存在。其中三個單體處于三個不同的構(gòu)象，即:進(jìn)入狀態(tài)（A態(tài)），結(jié)合狀態(tài)(B態(tài)）和排出狀態(tài)(E態(tài)）。這三個連續(xù)的狀態(tài)似乎暗示了AcrB在轉(zhuǎn)運(yùn)底物時構(gòu)象變化的機(jī)理可能是三態(tài)依次循環(huán)(three-step functionally rotating mechanism)，即A→B→E→A的構(gòu)象依次變化的機(jī)理。一些結(jié)構(gòu)和生化實驗的結(jié)果

10、在一定程度上支持這一機(jī)理，但是都無法直接證實，而且目前關(guān)于AcrB的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理還有很多問題亟待解釋。我們首先對AcrB體系做了常規(guī)分子動力學(xué)模擬，結(jié)果表明在AcrB三聚體中PD結(jié)構(gòu)域，尤其是其中PC2子結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象運(yùn)動比較明顯;另外我們還發(fā)現(xiàn)在B單體結(jié)合口袋有底物結(jié)合的情況下，質(zhì)子化狀態(tài)D407HD408H(E)晶體結(jié)構(gòu)在50ns的模擬中比較穩(wěn)定。但是通過普通分子動力學(xué)模擬很難完成AcrB的功能性構(gòu)象轉(zhuǎn)換，我們隨后采用了正則模式分析和靶向

11、分子動力學(xué)模擬方法對AcrB進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)單體低頻模式中以PD結(jié)構(gòu)域的運(yùn)動為主，而且低頻模式對構(gòu)象轉(zhuǎn)換都有較大的貢獻(xiàn)。AcrB三聚體的正則模式分析表明單體內(nèi)PD結(jié)構(gòu)域與TMD結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象耦合很弱，但是單體之間卻有明顯的構(gòu)象耦合，另外不同單體之間的PN結(jié)構(gòu)域相關(guān)性較強(qiáng)。靶向分子動力學(xué)模擬揭示的整個構(gòu)象轉(zhuǎn)換(ABE→BEA)過程是從A→B構(gòu)象變化中PN2子結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象運(yùn)動開始的，通過三個單體PN子結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象耦合傳遞到B和E單體;

12、而PD結(jié)構(gòu)域，尤其是PC2子結(jié)構(gòu)域的內(nèi)在構(gòu)象柔性可能為隨后的構(gòu)象變化提供了熵驅(qū)動力，推動整個轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)。我們發(fā)現(xiàn)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)和質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)路徑的構(gòu)象變化都是在PD結(jié)構(gòu)域中的整體構(gòu)象運(yùn)動結(jié)束后才開始的，因此質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)路徑中局部殘基側(cè)鏈的構(gòu)象變化可能是底物轉(zhuǎn)運(yùn)的決速步驟。
　　底物離開AcrB之后，通過TolC外膜蛋白，排到細(xì)胞外。TolC外膜蛋白是一個跨膜孔道蛋白，在其晶體結(jié)構(gòu)的構(gòu)象中，TolC的細(xì)胞外端和細(xì)胞周質(zhì)端都處于關(guān)閉狀態(tài)，有兩個門徑

13、:細(xì)胞外門徑(EG)和細(xì)胞周質(zhì)端門徑(PG）。細(xì)胞外門徑是由三個無規(guī)線團(tuán)(loop)組成的，細(xì)胞周質(zhì)端門徑則是由向內(nèi)彎曲的α-螺旋束形成的，在入口端的氫鍵和鹽橋網(wǎng)絡(luò)使其處于閉合狀態(tài)。為了了解藥物分子通過TolC孔道的自由能途徑，我們計算了鈉離子和阿霉素(doxorubicin，DOX)沿著TolC孔道中軸線坐標(biāo)的平均力勢(Potential of Mean Force，PMF)，發(fā)現(xiàn)阿霉素和鈉離子通過時，TolC的細(xì)胞周質(zhì)端門徑(PG)

14、的打開都會發(fā)生，而且其打開是由底物決定的。但是這個區(qū)域的構(gòu)象變化并不會導(dǎo)致鈉離子通過時的能壘。細(xì)胞外無規(guī)線團(tuán)和殘基Lys283會導(dǎo)致鈉離子的滲透能壘，但是由于阿霉素與蛋白之間廣泛的相互作用，阿霉素在這個區(qū)域內(nèi)并沒有能壘。TolC在鈉離子通過時具有較高的構(gòu)象柔性，但是阿霉素似乎可以穩(wěn)定其關(guān)閉構(gòu)象。AcrB的存在并不能幫助TolC打開其細(xì)胞周質(zhì)端門徑，而TolC細(xì)胞周質(zhì)端門徑的打開會引起TolC-AcrB復(fù)合物的解體。為了采樣到TolC構(gòu)象

15、空間中更多處于打開狀態(tài)的構(gòu)象，我們做了各種突變體的分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)采樣空間中的大部分構(gòu)象都是不對稱的，但是打開程度最大的構(gòu)象（完全打開構(gòu)象）卻是對稱的。我們還通過靶向分子動力學(xué)模擬方法模擬了由關(guān)閉狀態(tài)到打開狀態(tài)的全過程，發(fā)現(xiàn)打開過程中呈現(xiàn)不對稱構(gòu)象。
　　AcrAB-TolC體系的另一個組成部分是膜融合蛋白AcrA，它是一個鐮刀型、拉長結(jié)構(gòu)的分子，包含四個結(jié)構(gòu)域:α螺旋發(fā)卡結(jié)構(gòu)域(α-hairpin domain)、硫辛結(jié)構(gòu)域

16、(lipoyl domain)、β桶結(jié)構(gòu)域(β-barrel domain)，和近膜結(jié)構(gòu)域(membraneproximal(MP) domain)。目前AcrA蛋白在AcrAB-TolC體系中行使其功能的作用機(jī)理還不清楚。AcrA的晶體結(jié)構(gòu)只得到了部分結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，缺少N端和C端，而且還引入了四個突變。功能實驗表明缺少C端的AcrA和引入四個突變的AcrA對很多底物的耐藥性都消失了。結(jié)構(gòu)研究和順磁共振(EPR)實驗都顯示AcrA具有很

17、高的構(gòu)象柔性，而且pH可以誘導(dǎo)構(gòu)象變化。我們以MexA為模板通過同源建模構(gòu)建了AcrA的完整結(jié)構(gòu)，在不同pH值的條件下做了全原子分子動力學(xué)模擬，結(jié)果表明兩個模型的結(jié)構(gòu)域內(nèi)部都很穩(wěn)定，構(gòu)象柔性主要來自于α-hairpin和MP結(jié)構(gòu)域的整體構(gòu)象運(yùn)動。AcrA的構(gòu)象對局部突變和pH值都很敏感。與EPR實驗結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)將pH值由7.0降低到5.0會限制AcrA結(jié)構(gòu)域之間的構(gòu)象運(yùn)動，而His285的質(zhì)子化狀態(tài)會改變局部的氫鍵相互作用，調(diào)節(jié)p

18、H引起的構(gòu)象變化?；贏crB、TolC的晶體結(jié)構(gòu)和AcrA的完整結(jié)構(gòu)模型，我們通過分子對接得到了AcrAB-TolC復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型，并對該模型做了正則模式分析，結(jié)果表明在AcrB和TolC沒有直接接觸的結(jié)構(gòu)之間也會有構(gòu)象的耦合，而AcrA的加入會顯著增強(qiáng)AcrB和TolC的構(gòu)象耦合。
　　我們對AcrAB-TolC多重耐藥性外排泵體系的構(gòu)象柔性和底物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)和全面的研究，在原子水平上提供了底物轉(zhuǎn)運(yùn)過程中AcrAB-T