G-四鏈體結構表征在Pu39WT結構推測中的應用及其體外生物學功能初探.pdf

1、核酸是生命體內重要的功能大分子之一，而脫氧核糖核酸(DNA)則作為遺傳密碼的載體承載著絕大多數生物物種的全部遺傳信息。除外生物體內大多數DNA的存在形式——Watson Crick DNA右手雙螺旋結構(B型DNA)之外，目前研究中已發(fā)現DNA還具有多種其他不同的二級結構，包括右手螺旋(A型DNA)、左手螺旋（Z型DNA）、三聯體螺旋（H型DNA）、四聯體螺旋（G-四鏈體）、十字形結構、發(fā)夾式結構、和i-motif序列等。其中，G-四鏈

2、體是生物體內富含鳥嘌呤殘基的核苷酸序列形成的一種特殊核酸二級結構，這一結構的形成對于真核細胞的端粒區(qū)和基因組區(qū)某些重大生物學過程具有重要影響，例如在啟動子中G-四鏈體的形成會影響其下游基因的復制與表達。由此探討DNA的結構與功能的關系具有十分重要的意義，可以加深對生命本質的認識以及拓展DNA在各個領域的應用，如針對G-四鏈體為治療靶點的抗腫瘤藥物的研究。
　　本課題主要運用圓二色譜儀，紫外分光光譜儀以及電泳儀等儀器研究了在不同離子

3、（鉀或鈉）環(huán)境下，不同富G序列形成的多種G-四鏈體結構構象，分析研究了不同G-四鏈體結構構象分別在CD光譜、TDS光譜、UV熱力學分析和電泳遷移中的表現特征;并應用這些特征針對人Bcl-2基因P1啟動子上游的富G序列Pu39WT分別在鉀離子和鈉離子環(huán)境下形成的G-四鏈體結構進行綜合分析，再加上通過對序列進行人工截短研究和文獻中的相關報道模擬出了Pu39WT全長序列在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下可能形成的兩種(3+1)型G-四鏈體混合結

4、構構象。最后，我們在體外考察了Pu39WT全長序列及其人工截短序列與氯化血紅素結合形成DNA過氧化物酶后的催化氧化反應的能力及活性，還在聚合酶鏈式反應阻止實驗中考察了該組序列的結構變化對PCR阻止效應帶來不同程度影響的生物學表現。
　　研究結果表明:在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下，富G核苷酸序列有形成不同結構構象的趨勢，并且G-四鏈體的不同構象在上述方法學中的特征表現各有特點:1、在CD光譜中:平行G-四鏈體在波長240.0nm

5、和265.0nm左右處分別有特征負峰和正峰;反平行G-四鏈體在波長265.0nm和295.0nm左右處有特征負峰和正峰;平行與反平行共存或混合G-四鏈體在波長240.0nm和265.0nm左右處有特征負峰和正峰，并在波長295.0nm左右處有次正峰。2、在紫外融解曲線中:鉀離子比鈉離子環(huán)境中形成的G-四鏈體結構更穩(wěn)定（融解溫度值更高）;加熱對G-四鏈體的熱力學穩(wěn)定性有一定破壞作用;單分子結構的G-四鏈體的熱力學參數值較大（絕對值小），雙

6、分子及多分子結構的G-四鏈體的熱力學參數值較小（絕對值大）。3、在紫外TDS圖譜中:平行G-四鏈體在波長240.0nm和273.0nm左右處有一特征正峰，同時在波長295.0nm左右處有一特征負峰，在波長260.00nm左右是兩峰之間存在清晰波谷;反平行G-四鏈體在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm左右處有較小正峰，同時在波長295.0nm左右處有最低特征負峰，而在波長260.0nm處形成波峰波谷混合區(qū)帶;混合

7、G-四鏈體在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm左右處有次高正峰，同時在波長295.0nm左右處有強度相當于273.0nm處的最低特征負峰，而在波長260.0nm處（240.0nm和273.0nm兩正峰之間）存在獨立清晰第三正峰。4、在非變性PAGE中:平行G-四鏈體多為多分子（四分子或更多）結構;反平行G-四鏈體多為單分子結構;混合G-四鏈體多數為單分子結構，僅個別為雙分子結構。
　　結合上述結果對序列P

8、u39WT分別在鉀離子和鈉離子環(huán)境下進行結構分析，根據其特征:1、在CD光譜中:在波長240.0nm和265.0nm左右處有特征負峰和正峰，并在波長295.0nm左右處有次正峰，為平行與反平行共存或混合G-四鏈體特征。2、在紫外融解曲線中:鉀離子比鈉離子環(huán)境中形成的G-四鏈體結構更穩(wěn)定（融解溫度值更高）;單分子G-四鏈體的熱力學參數值較大（絕對值?。?、在紫外TDS圖譜中:在波長273.0nm左右處有最高特征正峰，在波長240.0nm

9、左右處有次高正峰，同時在波長295.0nm左右處有強度相當于273.0nm處的最低特征負峰，而在波長260.0nm處（240.0nm和273.0nm兩正峰之間）存在獨立清晰第三正峰，亦說明為混合G-四鏈體。4、在非變性PAGE中:條帶為單分子結構。綜合分析出Pu39WT為單分子的混合G-四鏈體結構。而變異序列發(fā)生不同程度的變化，其中第2、5、7個G島的結構組成性比較重要，由此模擬出了全長序列在不同離子（K+或Na+）環(huán)境下可能形成的兩種

10、(3+1)式含有三個G-四聯體平面的G-四鏈體二級結構構象。
　　最后，我們在體外進行的DNA過氧化物酶實驗證明了Bcl-2基因P1啟動子上游Pu39WT全長序列與氯化血紅素結合后能夠形成DNA過氧化物酶，并且其DNAzyme在鉀和鈉離子緩沖液中均表現出較強的DNA過氧化物酶活性，說明Pu39WT作為該酶的活性中心具有較強的核酶生物學活性，這種活性很可能與其G四鏈體結構的形成緊密相關。而變異序列結合氯化血紅素形成的DNA過氧化物酶

11、作為對照大多數酶的活性均表現為下降，這很可能是由于Pu39WT序列發(fā)生變異后，DNA序列的變化造成酶活性中心的結構發(fā)生了改變進而影響了其酶活功能的發(fā)揮，更加說明核酶的活性強弱與其序列及結構緊密相關。
　　通過以上實驗，我們得到了大量可靠的實驗數據和結論，這不但能為進一步利用G-四鏈體的結構特征在富G序列結構判斷中的應用打下良好的基礎，還將對未來在基因啟動子中G-四鏈體的形成、結構構象與其生物學功能，以及G-四鏈體的結構構象與生物學