基于G-四鏈體DNA酶的傳感器設計及分子擁擠條件下G-四鏈體的穩(wěn)定性及識別研究.pdf

1、G-四鏈體DNA酶是G-四鏈體結合氯化血紅素(Hemin)后形成的一種具有過氧化物酶活性的人工酶。與天然酶相比，G-四鏈體DNA酶由于具有價廉、易得、便于存儲、修飾及設計靈活等優(yōu)勢，使其近年來在傳感器的設計方面得到了廣泛的應用。
　　就鳥嘌呤堿基G重復序列之間連接環(huán)長度對G-四鏈體形成的影響進行了研究。發(fā)現(xiàn)在連接環(huán)長度較長，寡核苷酸鏈不易形成G-四鏈體的情況下，可以通過將環(huán)序列設計成雙鏈結構的方法促進G-四鏈體結構的重新形成。這就

2、為傳感器的設計提供了一個新的途徑:利用靶標對雙鏈結構的調(diào)節(jié)作用來控制G-四鏈體DNA酶的活性。為證明這一點，在雙鏈結構區(qū)域引入T-T堿基錯配，破壞雙鏈結構使寡核苷酸鏈失去形成G-四鏈體的能力。Hg2+對T-T錯配的穩(wěn)定作用可以促進雙鏈結構的形成，寡核苷酸鏈重新折疊成G-四鏈體。得到的G-四鏈體與氯化血紅素(Hemin)結合后形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體DNA酶，從而實現(xiàn)了Hg2+傳感器的設計。利用該Hg2+傳感器，可在10～700

3、 nM濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)Hg2+的定量檢測，檢出限為8.7nM。在此基礎上，利用半胱氨酸可以把Hg2+從T-Hg2+-T堿基對上競爭下來的能力，又設計了一種半胱氨酸的定量檢測方法。該方法可以在20～600 nM的濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)半胱氨酸的定量檢測，檢出限為14nM。該傳感器設計策略可以很容易地擴展到其它一些金屬離子及適配體靶標的檢測當中。
　　生物體內(nèi)的細胞環(huán)境不是簡單的水溶液，胞內(nèi)環(huán)境不僅包含著可溶的小分子物質(zhì)，例如:各種代謝產(chǎn)物和金

4、屬離子，還包含著許多不可溶的大分子物質(zhì)，例如:多糖，蛋白質(zhì)，脂類物質(zhì)和核酸等。這些大分子在細胞內(nèi)的總濃度約為400 mg.mL-1，約占細胞體積的30～40％。分子擁擠(molecular crowding conditions)條件引起的“分子擁擠效應”不僅影響G-四鏈體的構型及穩(wěn)定性，還對G-四鏈體與小分子的作用有著顯著的影響。因此，在體外實驗中加入分子擁擠試劑用以模擬體內(nèi)的分子擁擠環(huán)境是非常有必要的。正是由于意識到了這一點，人們有

5、關G-四鏈體的研究正逐漸由稀溶液條件向分子擁擠條件過渡。
　　本論文選擇聚乙二醇PEG200作為分子擁擠試劑在體外模擬分子擁擠環(huán)境，利用圓二色光譜儀測定DNA鏈的構型以及紫外分光光度計測定DNA鏈的熔點(Tm)，考察了稀釋條件下和分子擁擠條件下鼓環(huán)的大小、數(shù)目對G-四鏈體構型和穩(wěn)定性的影響。結果表明:隨著鼓環(huán)的增大，DNA鏈形成的G-四鏈體構型不發(fā)生改變，但熔點逐漸降低，表明G-四鏈體結構的穩(wěn)定性逐漸降低;鼓環(huán)數(shù)目對G-四鏈體的構

6、型和穩(wěn)定性均有顯著影響，數(shù)目越多，穩(wěn)定性越低，G-四鏈體結構越不易形成，因此G-四鏈體結構中允許存在的鼓環(huán)數(shù)目應該是有一個限度的。通過對稀釋條件和分子擁擠條件下的對比，本文還得出分子擁擠條件能顯著提高G-四鏈體結構的穩(wěn)定性。上述結論拓展了我們對能形成G-四鏈體的DNA序列的認識:非G3+NG3+NG3+NG3+N結構的序列仍有望形成穩(wěn)定的G-四鏈體，為近生理條件下研究人體基因組中的G-四鏈體結構提供了可能性。
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