新型萘酰亞胺化合物NA17誘導(dǎo)非小細胞肺癌NCI--H460細胞凋亡的作用機制研究.pdf

1、肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因之一，在肺癌患者中80％-90％為非小細胞肺癌(NSCLC)。近40年來，由于一直未找到有效的治療方法，致使肺癌轉(zhuǎn)移患者的總體存活率不足一年。分子靶向治療藥物的問世，重新鼓舞了人們對于肺癌治療的信心。但以EGFR為靶點的分子靶向治療藥物并沒有改善肺癌晚期患者致死率高的現(xiàn)狀。因此，針對肺癌特別是非小細胞肺癌分子遺傳學(xué)背景尋找新型治療靶點是開發(fā)臨床有效靶向治療藥物的關(guān)鍵所在。其中抑癌基因p53失活也已成為非小細

2、胞肺癌發(fā)病和治療無效的常見誘因，在非小細胞肺癌重構(gòu)p53功能作為有效的靶向治療手段引起了國內(nèi)、外學(xué)者的高度關(guān)注。
　　本課題組自主組合成了一系列新型萘酰亞胺衍生物，pp53-TA-Luc報告基因篩選結(jié)果顯示萘酰亞胺衍生物NA17可以顯著增加p53的活性，且能夠有效抑制腫瘤細胞株的生長。但是NA17的作用靶點及其發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制尚不清晰，本文利用分子藥理學(xué)領(lǐng)域的多種實驗方法對NA17的抗腫瘤作用機制進行了深入的研究，明確了N

3、A17的作用靶點，為該化合物的后續(xù)研究提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。
　　1.本文首先通過MTT法對NA17進行體外抗腫瘤活性篩選。對腫瘤細胞株(NCI-H460、BEL-7404、HCT-116、MCF-7、Hep G2、MGC-803)和正常細胞株(HL-7702、WI-38)進行細胞活力檢測，結(jié)果表明NA17具有廣譜的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞株均表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用，而且對正常細胞毒性較低，有較好的選擇性。不同種類的非小細胞

4、肺癌細胞株(NCI-1975、NCI-358、NCI-827)對NA17的敏感程度不同，這主要與其內(nèi)源性p53活化程度不同有關(guān)。此外，通過RNA干擾降低內(nèi)源性p53的表達能顯著降低腫瘤細胞對NA17的敏感性，說明NA17是通過激活p53發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　2.蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果表明NA17以濃度依賴性方式誘導(dǎo)p53絲氨酸392位點磷酸化(p-p53s392)。亞細胞分布、DNA損傷檢測、Coip-MS和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果

5、顯示NA17是在細胞質(zhì)中與NCI-H460細胞中的p53直接相互作用，使野生型p53活化，而不是通過DNA損傷或者增加內(nèi)源性p53的表達。
　　3.通過流式細胞術(shù)檢測NA17對細胞周期的影響。結(jié)果表明，NA17將NCI-H460細胞阻滯在G1期。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測G1期相關(guān)調(diào)控蛋白的表達量，結(jié)果表明，NA17可以通過上調(diào)G1期監(jiān)測點調(diào)控蛋白p21的表達來影響cyclin-CDK4復(fù)合體的活性從而有效誘導(dǎo)細胞阻滯在G1期。<

6、br>　　4.通過Hoechst33258染色、AIF免疫熒光檢測、caspase-3激活檢測NA17對細胞凋亡的影響。結(jié)果表明NA17可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生早期凋亡。AIF亞細胞分布實驗、線粒體中關(guān)鍵凋亡蛋白Bcl-xl的下調(diào)和Bim、Bax以及Bak的上調(diào)說明NA17是通過內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)細胞凋亡。分子水平進一步研究表明，磷酸化p53(p-p53)靶向線粒體并在線粒體中聚積使得Bak構(gòu)象激活，導(dǎo)致細胞凋亡。
　　本文系統(tǒng)的研究了N