MBF2家族鑒定及其成員MBF2-1參與絲素重鏈轉錄調控的研究.pdf

1、家蠶能成為重要的經濟昆蟲，主要原因在于其可以分泌蠶絲。蠶絲是由家蠶高度特化的器官-絲腺合成分泌的。根據(jù)絲腺各區(qū)段的結構形態(tài)不同，將絲腺分成前部、中部及后部絲腺。絲的兩大組成部分—絲素和絲膠，分別是由后部絲腺及中部絲腺合成。其中，絲素是蠶絲的主要組成部分，它由絲素重鏈蛋白、絲素輕鏈蛋白及 P25蛋白組成的多聚體蛋白。絲蛋白的表達不僅具有組織特異性，還具有明顯的時期特異性。絲蛋白在幼蟲前幾個齡期合成少量絲蛋白，主要用于眠期時，將自己固定在蠶

2、座上，以便蛻皮。絲蛋白只有在幼蟲最后一齡末期才被大量合成。先前研究表明，絲蛋白的調控主要在轉錄水平，并且絲蛋白的轉錄發(fā)生在每齡盛食期，在眠期則不再轉錄。雖然研究學者對絲腺高效的蛋白合成能力和基因表達的調控機制進行了持續(xù)的研究，但是目前只有少量的絲蛋白轉錄因子被鑒定，絲蛋白的高效特異表達的調控機制仍待進一步闡明。
　　多蛋白橋梁因子 MBF2最初在絲腺中被分離并證明作為轉錄調控因子發(fā)揮作用。劉慶信等人研究發(fā)現(xiàn) MBF2在絲腺中大量存

3、在，且在絲腺并呈現(xiàn)周期性表達。我們推測 MBF2在絲腺中發(fā)揮著重要功能。基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫這一信息平臺，對 MBF2進行了分析并對其在絲素重鏈基因轉錄調控中的作用進行了研究，研究結果如下：
　　1.家蠶MBF2家族基因的鑒定、表達分析及功能研究
　　以MBF2氨基酸序列為質詢序列，采用BLASTP程序檢索家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫及 NCBI庫，獲得了9個家族候選基因，并將其分別命名為 MBF2-1、-2、-3、-4、-5、-6

4、、-7、-8、-9。信息分析結果顯示，它們均有 EST數(shù)據(jù)，且有些基因在染色體上成簇分布。氨基酸序列預測分析結果顯示該家族基因編碼的氨基酸殘基數(shù)目范圍為109-118個，且在N端均有信號肽，表明該家族基因在合成過程中需跨膜，很可能為分泌型蛋白。序列比對結果顯示，家蠶 MBF2成員有較高的同源性，序列一致性高達41％。進化分析結果顯示，該家族基因為昆蟲特有的一類基因，家蠶 MBF2-1、MBF2-2、MBF2-3及 MBF2-7在進化樹中

5、聚成一簇，并且它們與黑脈金斑蝶及樗蠶蛾的MBF2有著較近的進化關系。其他成員與參與免疫反應的病原體響應基因βREPAT聚成一簇，說明該基因家族很可能參與家蠶的免疫反應。
　　組織表達譜分析結果顯示該家族基因成員具有明顯的組織特異性，MBF2-1在絲腺及馬氏管中髙量表達，MBF2-5在中腸中髙量表達， MBF2-2、MBF2-3、MBF2-4、MBF2-6和MBF2-8在血液中髙量表達。而MBF2-7在脂肪體，精卵巢中較高的量的表達

6、。時期表達譜分析結果則顯示，該家族基因表達呈現(xiàn)明顯的時期特異性，有些在預蛹期及蛹期髙量表達如 MBF2-4、-6、-8和-9；而有些基因在蛹期的表達量較低但在幼蟲期髙量表達，如 MBF2-2、MBF2-3、MBF2-5；而MBF2-1與上述基因均不同，在五齡期及預蛹期髙量表達；MBF2-7則各時期均有表達，但在眠期的表達量較低。幼蟲期是家蠶攝取食物獲得能量的時期，而蛹期則是完成成蟲組織器官的發(fā)生、形成、以及生殖細胞的發(fā)育、成熟的時期。絲

7、腺、中腸、血液和脂肪體等組織均是是家蠶物質和能量代謝的主要組織，表達譜分析顯示 MBF2家族成員在這些組織及時期髙量表達，說明這些基因在家蠶代謝及發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。
　　Bb攻毒實驗結果顯示，MBF2-4、MBF2-7、MBF2-9在注射 Bb后1h被明顯的上調表達，然后在注射3h后下調；MBF2-8則在注射12h后才被上調表達然后恢復到正常水平；與上述基因相反，MBF2-2和 MBF2-3在注射 Bb后3h被明顯的下調了

8、，緊接著恢復到正常的表達水平。結果表明這些基因參與家蠶對Bb的免疫反應。饑餓及恢復食桑實驗結果顯示，MBF2-1、-4及-8在饑餓的條件下被下調表達，而當恢復食桑后，基因開始上調表達；而 MBF-2、-3、-6及-7則呈現(xiàn)出相反表達模式， MBF2-5及 MBF2-9的表達模式上來看，它們的表達同樣被影響，但是與其他基因相比，變化的比較遲緩。以上結果表明該家族基因與營養(yǎng)代謝有著很緊密的關聯(lián)。
　　2. MBF2的原核表達及表達模式

9、分析
　　通過構建原核表達載體并誘導表達純化MBF2蛋白，并制備了多克隆抗體并用于后續(xù)實驗。絲腺不同區(qū)段qPCR結果顯示， MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉錄。絲腺不同區(qū)段Western blot結果顯示，不僅在后部絲腺檢測到了MBF2蛋白的存在，在前部絲腺及中部絲腺也檢測了MBF2蛋白的存在。蠶絲免疫熒光結果顯示，MBF2蛋白定位在絲膠層，且繭的最外層含量最高。以上結果表明該蛋白是一個分泌型蛋白,這與前面的預測是一致的。MBF2家族成

10、員MBF2-8已經被證明可以參與家蠶的免疫反應，說明繭中的MBF2很可能發(fā)揮抵御外來病原入侵的作用，這對以后研究MBF2在免疫方面的功能奠定了基礎。
　　對MBF2在后部絲腺的表達時期進行Western blot及qPCR分析，結果顯示MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉錄，在四齡眠期髙量表達，在五齡前期也有較髙量的表達，而在五齡后期及上蔟其基本不表達。MBF2呈現(xiàn)出與fibH相反的表達模式，暗示MBF2可能參與絲素重鏈基因的轉錄。

11、　　3. MBF2基因參與fibH的轉錄調控
　　為了檢測MBF2是否參與fibH的調控，我們采用了雙螢光素酶報告系統(tǒng)，首先，構建了MBF2細胞過表達載體及fibH的螢火蟲螢光素酶報告載體，將它們轉入BmE細胞，并進行了酶活測定。結果顯示，過表達MBF2可以影響fibH啟動子的活性。然而對MBF2的氨基酸序列分析，沒有預測到可以與DNA結合的功能域。那么MBF2很可能通過與其他的轉錄因子相互作用調控fibH的轉錄。通過亞細胞定位，

12、我們發(fā)現(xiàn)MBF2與Bmdimm共定位于細胞核。為進一步確定它們之間的關系，通過利用體外原核表達重組蛋白進行Far-western實驗，結果顯示，MBF2在體外可以與Bmdimm相互作用。此外，在家蠶BmE細胞系中進行BiFC實驗，結果顯示，MBF2與Bmdimm可以相互作用。以上結果表明MBF2可以與Bmdimm相互作用。有意思的是，Bmdimm已經證明參與絲素重鏈調控且對絲素重鏈起到正調控的作用，但是，當我們同時過表達MBF2和Bmd

13、imm時，fibH啟動子的活性下調。結果表明MBF2可以抑制Bmdimm對fibH的調控作用并下調fibH啟動子的活性。
　　4. FTZ-F1參與fibH轉錄調控
　　已經有文獻報道 MBF2可以參與 FTZ-F1對下游基因的轉錄調控，但是兩者之間是否存在直接的相互作用關系尚未得知。我們首先原核表達，純化FTZ-F1蛋白并制備抗體。qPCR及Western blot分析結果顯示，F(xiàn)TZ-F1在五齡三天的各組織中均有表達。其

14、中，五齡三天各組織Western blot結果顯示FTZ-F1在絲腺、馬氏管中的表達量較高。時期表達譜分析結果顯示，F(xiàn)TZ-F1在眠期的后部絲腺表達量最高，五齡期以后表達量逐漸降低，在五齡末期及上蔟期基本不表達，這種表達模式與 MBF2表達模式一致，而與 fibH表達模式相反。亞細胞定位、Co-IP、BiFC及 Far-western等實驗結果顯示 FTZ-F1與MBF2可以相互作用。我們已經證明了MBF2可以參與fibH的轉錄調控。那

15、么FTZ-F1是否也參與fibH的轉錄調控呢？
　　我們對 fibH啟動子進行了分析，分析結果顯示，在 fibH啟動子的-389~-397及-652~-659處存在FTZ-F1潛在的結合位點。EMSA及ChIP實驗結果顯示FTZ-F1可以與 fibH（-389~-397）位點結合。當我們將啟動子該位點突變或是截短時，fibH啟動子的活性上調。為了對這一點進行進一步檢測，將該位點突變后的fibH啟動子螢光素酶報告載體與 FTZ-F1

16、過表達載體共轉進行酶活檢測，結果顯示，對 fibH啟動子活性沒有顯著性變化。以上實驗結果顯示家蠶FTZ-F1通過結合該位點調控fibH啟動子活性。
　　我們已經證明單獨過表達MBF2或FTZ-F1均可以下調fibH的啟動子的活性，并且它們存在相互作用。為了研究兩者是否可以一起作用調控fibH，我們將MBF2及FTZ-F1同時過表達，結果顯示，fibH啟動子的活性下調更加顯著。結果說明MBF2與FTZ-F1相互作用并參與fibH的轉

17、錄調控作用。qPCR分析FTZ-F1及MBF2在大造及高絲量的品種872中后部絲腺的表達量，結果顯示MBF2及FTZ-F1在872中的表達量遠遠低于大造中的表達量。
　　有趣的是，對fibH啟動子進行分析，發(fā)現(xiàn)fibH啟動子上FTZ-F1與Bmdimm的結合位點靠的很近，我們已經證明它們均與MBF2相互作用。那么它們之間是否存在相互作用呢？我們對此進行了研究。BiFC及Far-western實驗結果顯示，F(xiàn)TZ-F1可以與Bmdi

18、mm相互作用。雙螢光素酶報告系統(tǒng)結果顯示，單獨過表達Bmdimm時， fibH啟動子活性上調。當將FTZ-F1與Bmdimm共表達時， fibH啟動子的活性無明顯變化。結果表明BmFTZ-F1可以抑制Bmdimm對fibH啟動子活性的上調作用。
　　5.蛻皮激素對fibH調控的影響
　　到目前為止，關于蛻皮激素調控家蠶fibH的報道比較少。為了研究蛻皮激素對家蠶fibH轉錄調控的影響，我們將fibH啟動子的螢光素酶報告載體轉

19、入細胞，然后用蛻皮激素處理細胞，酶活檢測結果顯示，20E可以調控fibH啟動子活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴性的影響。那么20E是怎么實現(xiàn)對fibH調控的呢？
　　已經有文章報道，無論在體內還是在體外，當用20E處理后部絲腺時均可以誘導FTZ-F1的表達。MBF2與FTZ-F1在后部絲腺中有著相似的表達模式。那么MBF2是否受蛻皮激素調控呢？我們對MBF2啟動子進行了預測分析，分析結果顯示，在MBF2啟動子上游有BrC、EcR、E74A等

20、多個核激素受體的作用元件。蛻皮激素的誘導實驗結果顯示，無論是在體內還是體外，MBF2均被20E上調表達，我們還發(fā)現(xiàn)當MBF2被上調表達時，fibH的表達量卻下調了。該結果說明20E很可能通過調控MBF2參與fibH的轉錄調控。我們已經證明MBF2可以與FTZ-F1相互作用并參與fibH的調控。有文獻報道20E可以誘導后部絲腺內FTZ-F1的表達。綜合以上結果表明蛻皮激素可以通過MBF2及FTZ-F1介導調控fibH的轉錄。
　　綜