鼠李糖乳桿菌fmb-9產(chǎn)抑菌物質(zhì)的研究及其培養(yǎng)基優(yōu)化.pdf

1、乳酸菌在自然界中大量存在，是最常見的益生菌之一，被廣泛應(yīng)用在食品生產(chǎn)、醫(yī)療保健和飼料工業(yè)中。乳酸菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，包括細(xì)菌素、有機(jī)酸和多種酶類，這些活性物質(zhì)中很多都具有抑菌能力。隨著社會(huì)的進(jìn)步和生活水平的提高，人們對(duì)于食品安全的要求也越來(lái)越高。目前普遍使用的食品添加劑主要是化學(xué)添加劑，這類物質(zhì)的大量使用嚴(yán)重影響著人體的健康。因此，尋找安全、穩(wěn)定、高效的抑菌物質(zhì)是目前食品添加劑的主要研究方向。乳酸菌作為一種益生菌，它所產(chǎn)生的抑菌

2、物質(zhì)是被公認(rèn)安全的，使用這類物質(zhì)作為食品添加劑，將會(huì)極大的提高我國(guó)食品的安全性。
　　乳酸菌fmb-9是本實(shí)驗(yàn)室保藏的一株具有抑菌能力的菌株，分離自泡菜中。本研究旨在對(duì)乳酸菌fmb-9進(jìn)行篩選活化和分類鑒定，并分析它所產(chǎn)生抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)，初步研究分離純化方法，最后優(yōu)化菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)基，為進(jìn)一步開發(fā)利用天然抑菌物質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)保藏的乳酸菌fmb-9進(jìn)行活化和復(fù)壯，并對(duì)復(fù)壯的菌株進(jìn)行分類

3、鑒定。菌落形態(tài)觀察具有典型的乳酸菌特征，革蘭氏染色鏡檢顯示陽(yáng)性，生理生化特性研究初步確定菌株屬于乳酸桿菌。在分子生物學(xué)鑒定中，通過(guò)總基因組提取、PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1437bp的16SrDNA序列，與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性比對(duì)后，根據(jù)研究結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示菌株fmb-9的16SrDNA序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中多株菌的序列同源性達(dá)到99％以上，確定菌株屬于鼠李糖乳桿菌（Lactobacillusr

4、hamnosus）。
　　2.抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌fmb-9產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有較廣的細(xì)菌抑菌譜，能夠抑制短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌等致病菌，但對(duì)真菌沒有抑制效果。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，菌株生長(zhǎng)4h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16h進(jìn)入穩(wěn)定期;發(fā)酵中培養(yǎng)基pH值持續(xù)下降，最終穩(wěn)定在pH3.8;菌株發(fā)酵2h即開始產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，36h左右抑菌活性達(dá)到最高。抑制排除實(shí)驗(yàn)和蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)酵液的抑菌活性與有機(jī)酸和過(guò)氧化氫

5、無(wú)關(guān)，抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K均有一定的敏感性，推測(cè)該物質(zhì)可能具有蛋白特性。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明，抑菌物質(zhì)對(duì)于溫度、pH值、紫外線均有很好的耐受性，其抑菌活性顯現(xiàn)范圍為pH2.0-5.0，在pH值大于5.0的環(huán)境中將失去抑菌能力。
　　3.分離純化實(shí)驗(yàn)證明，酸沉、萃取和層析柱分離對(duì)乳酸菌fmb-9產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)均有較好的純化效果。抑菌物質(zhì)在pH2.0處不被沉降;該物質(zhì)易溶于甲醇中，基本不能被正己烷和乙酸乙

6、酯溶解;葡聚糖凝膠柱層析能夠有效分離抑菌物質(zhì)。初步的分離流程為:首先調(diào)節(jié)發(fā)酵液為pH2.0進(jìn)行酸沉，其次使用正己烷和乙酸乙酯萃取，對(duì)萃余液進(jìn)行濃縮后采用甲醇復(fù)溶，溶液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析分離。抑菌物質(zhì)的最大吸收峰在222nm處，通過(guò)HPLC分析認(rèn)為該物質(zhì)具有較大的極性。
　　4.選擇番茄培養(yǎng)基1號(hào)作為初始培養(yǎng)基。通過(guò)培養(yǎng)基組分篩選，選出最合適的發(fā)酵材料為番茄汁、土豆汁、玉米汁，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為大豆蛋白胨。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、