偏腫革裥菌三個錳過氧化物酶基因在構(gòu)巢曲霉中的表達(dá).pdf

1、白腐菌分泌的酶類具有降解木質(zhì)素的特性，這些酶類主要包括錳過氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)、漆酶(Laccase，Lac)和木質(zhì)素過氧化物酶(LigninPeroxidase，LiP)等。MnP在生物技術(shù)應(yīng)用中極具吸引力，對于木質(zhì)素和多環(huán)芳烴等多種異生物質(zhì)，MnP具有獨(dú)特的胞外降解能力。偏腫革裥菌(Lenzites gibbosa)具有較強(qiáng)的木質(zhì)素分解能力，是我國東北林區(qū)常見的一種白腐菌，其產(chǎn)MnP和漆酶的活

2、性較高，近年來對其培養(yǎng)特性、MnP和LiP基因克隆與表達(dá)等方面已有一系列研究。真核生物表達(dá)體系是高效表達(dá)蛋白的可行有效方法，但是研究表明偏腫革褶菌錳過氧化物酶在畢赤酵母中表達(dá)量較低。絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成熟，其中曲霉具有生長迅速、表達(dá)量大、胞外分泌率高、生產(chǎn)的外源蛋白具有天然活性等優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)巢曲霉（Aspergillusnidulans）的轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)成功地建立。研究白腐菌MnP的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化與表達(dá)，為增加酶的產(chǎn)量提供新的途徑，對

3、進(jìn)一步構(gòu)建優(yōu)良工程菌株具有重要意義和理論價值。本研究構(gòu)建了偏腫革裥菌MnP表達(dá)重組質(zhì)粒，摸索并成功制備了構(gòu)巢曲霉原生質(zhì)體，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將偏腫革裥菌3個MnP同工酶基因轉(zhuǎn)化到了構(gòu)巢曲霉中，結(jié)果成功獲得3個偏腫革裥菌MnP同工酶基因的構(gòu)巢曲霉工程菌株。
　　主要研究成果如下:
　　本研究首先對構(gòu)巢曲霉尿嘧啶尿苷營養(yǎng)缺陷體菌株TN02A7進(jìn)行了制備分生孢子原生質(zhì)體酶解方法的摸索，結(jié)果表明將溶壁酶、纖維素酶和蝸牛酶3種酶以1

4、∶1∶1的比例混合，能有效地使構(gòu)巢曲霉的分生孢子形成原生質(zhì)體。
　　利用RT-PCR方法克隆得到偏腫革裥菌g-mnp1、Lg-mnp2和Lg-mnp3完整MnP同工酶CDS基因。首先構(gòu)建了載體質(zhì)粒pMDTM18-T/Lg-mnp1、pMDTM18-T/Lg-mnp2和pMDTM18-T/Lg-mnp3。將pMDTM18-T/Lg-mnp1、pMDTM18-T/Lg-mnp2、pMDTM18-T/Lg-mnp3和整合型表達(dá)載體質(zhì)粒p

5、LB01分別進(jìn)行雙酶切，利用T4連接酶進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pLB01/ Lg-mnp1、pLB01/ Lg-mnp2和pLB01/ Lg-mnp3。通過CaCl2/PEG原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，以營養(yǎng)缺陷體菌株TN02A7為宿主菌，將重組質(zhì)粒整合到構(gòu)巢曲霉中進(jìn)行MnP的異源表達(dá)，結(jié)果篩選到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，成功獲得轉(zhuǎn)化子菌株TN02A7-Lg-mnp1、TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3。將轉(zhuǎn)化子菌株、菌株T

6、N02A7和偏腫革褶菌CB1在相同的木質(zhì)素環(huán)境下接種于MMPGRT培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測MnP活性，結(jié)果表明在誘導(dǎo)表達(dá)過程中檢測前24h內(nèi)上清培養(yǎng)液中完全沒檢測到MnP活性，在24h時后檢測到Mnp活性，結(jié)果TN02A7-Lg-mnp1、TN02A7-Lg-mnp2和TN02A7-Lg-mnp3誘導(dǎo)96h后酶活最高分別為26.7U·L-1、17U·L-1和12U·L-1，在120h后活性基本沒有變化。而TN02A7始終無MnP酶活性，表