黃孢原毛平革菌錳過(guò)氧化物酶的研究.pdf

1、白腐擔(dān)子菌(White-rot Basidiomycetes)分泌的胞外錳過(guò)氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)是胞外降解木素體系的一種主要成分.來(lái)自白腐擔(dān)子菌的典型種黃孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)的錳過(guò)氧化物酶是一種需要H<,2>O<,2>的血紅素糖蛋白,其相對(duì)分子質(zhì)量范圍為4.5×10<'4>-4.7×10<'4>Dalton.本論文旨在確定黃孢原毛平革菌產(chǎn)錳過(guò)氧化物

2、酶的最優(yōu)培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵條件,并通過(guò)基因工程手段得到錳過(guò)氧化物酶(MnP2)基因的克隆,為進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)入適宜的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白異源表達(dá)奠定基礎(chǔ).其主要內(nèi)容包括以下兩個(gè)方面.1.黃孢原毛平革菌產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶最適條件的確定在靜置培養(yǎng)條件下,通過(guò)對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化,得到最優(yōu)組成為(L<'-1>):葡萄糖10g,酒石酸銨2mmol,吐溫80 1g,醋酸緩沖液10mmol(pH4.0),V<,B1> 1mg,,Mn<'2+>9.9×10<

3、'-6>g.采用該發(fā)酵限氮培養(yǎng)基,于34℃靜置培養(yǎng)5d,產(chǎn)MnP活力達(dá)1200 U/L,比未優(yōu)化提高近17倍.進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)酶最適的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終在250mL三角瓶中裝液量30mL;發(fā)酵限氮培養(yǎng)基pH4.5;接種后,孢子終濃度為6.7×10<'5>個(gè)孢子/mL;溫度37℃;靜置培養(yǎng)5d;產(chǎn)錳過(guò)氧化物酶活力達(dá)1452U/L,比未優(yōu)化條件MnP活力提高20﹪.2錳過(guò)氧化物酶(MnP2)基因的克隆以最適條件培養(yǎng)的菌絲為材料,采用Triza

4、l法提取黃孢原毛平革菌5.776總RNA并以之為模板進(jìn)行RT-PCR,成功擴(kuò)增出預(yù)期大小約為1.3kb的特異性條帶,將擴(kuò)增產(chǎn)物提純后與pUC19載體體外重組,轉(zhuǎn)化E. coli JM109,經(jīng)篩選及酶切鑒定后,獲得錳過(guò)氧化物酶(MnP2)基因的克隆.通過(guò)SDS-PAGE分析表明重組質(zhì)粒pUC19-mnp2/JM109比空質(zhì)粒pUC19/JM109在相對(duì)分子質(zhì)量4.5×10<'4>Dalton處多一條蛋白帶,其大小與黃孢原毛平革菌錳過(guò)氧化