澳大利亞平臍蠕孢霉膽紅素氧化酶的產(chǎn)生、特性及應(yīng)用研究.pdf

1、膽紅素氧化酶(EC1.3.3.5)，系多銅氧化酶家族中的一個成員，因其能催化膽紅素氧化為膽綠素而得名。本文從玉米葉片病斑中分離出一株產(chǎn)膽紅素氧化酶菌株，通過一系列的生物化學(xué)手段純化出胞外膽紅素氧化酶，繼而對該酶生化、酶學(xué)、光譜學(xué)、電磁學(xué)、電化學(xué)特性及制作成酶電極檢測血液中葡萄糖含量等應(yīng)用作了研究，其結(jié)果如下:
　　(1)膽紅素氧化酶產(chǎn)生菌的分離與鑒定
　　利用常規(guī)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)，從玉米葉片的病斑中分離出一株產(chǎn)膽紅素氧化

2、酶(BOD)的真菌。在原始發(fā)酵液中其酶活為1000 U/L。通過形態(tài)學(xué)、生理學(xué)特征和rDNA-ITS（登錄號為JN251106）序列分析，該菌株被鑒定為Bipolaris australiensis，命名為HD-1，屬子囊菌門、格孢腔菌目、格孢腔菌科、平臍蠕孢屬的澳大利亞平臍蠕孢霉(B.australiensis)，亦稱澳洲雙孢霉，是一株沒有被報道過的具有較高BOD酶活性的新菌株，為BOD的產(chǎn)生提供了新的資源。
　　(2)產(chǎn)酶條件

3、的優(yōu)化
　　通過單因素試驗從供試的13種碳源、22種氮源中找到了適合B.aurtraliensis HD-1產(chǎn)生BOD的適宜碳源為麥芽糖、庶糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉及海藻糖。適宜的氮源有聚蛋白胨、大豆蛋白胨、豆餅粉。適宜的誘導(dǎo)劑為CuSO4。通過二水平部分因子試驗及最陡爬坡試驗設(shè)計，從碳源、氮源、誘導(dǎo)劑、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH及搖床轉(zhuǎn)速七個因素中找到了對BOD產(chǎn)量影響最顯著的三個因素即麥芽糖含量、發(fā)酵溫度和CuSO4含量，通

4、過最陡爬坡試驗尋找到了逼近實驗的中心點后，利用響應(yīng)面法中的BB設(shè)計對上述三個主要因素進行優(yōu)化，得到:當培養(yǎng)基質(zhì)中初始組成含量（g/L）為:麥芽糖5，硫酸銅0.32，大豆蛋白胨50;發(fā)酵條件為:29.8℃，pH6.8，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，發(fā)酵培養(yǎng)6d，可獲得理論上最高酶活為2480 U/L，驗證實驗酶活達到2180 U/L，表明響應(yīng)面法優(yōu)化BOD的實驗結(jié)果可靠，通過發(fā)酵條件的優(yōu)化酶活比優(yōu)化前提高了2.5倍。
　　(3)酶蛋白的

5、純化和鑒定
　　將B.aurtraliensis HD-1發(fā)酵液通過硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾層析純化后，經(jīng)native-PAGE和SDS-PAGE檢測，獲得了具有BOD活性的電泳純單體蛋白，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)法測定斷裂后的蛋白質(zhì)片段序列，獲得135個氨基酸，利用Mascot軟件在NCBI蛋白庫中時行比對的結(jié)果表

6、明，該蛋白與來源于Helminthosporium tritici-vulgaris(燕麥長蠕孢霉)的漆酶前體蛋白序列同源性達100％。測定該酶蛋白表觀分子量為68 kDa，pI4.1。
　　(4)光譜學(xué)和電磁學(xué)特性
　　電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)法測得該酶含Cu,Zn,Fe原子，每分子BOD蛋白中含Cu、Zn、Fe原子的比率為1∶1∶4; UV-vis光譜學(xué)分析表明該蛋白具有典型多銅氧化酶家族的光譜學(xué)特

7、性，即T1銅在600 nm附近有一強吸收峰及T2、T3銅組成的三核銅中心在330 nm附近有一肩(shoulder)狀峰，所不同的是，該酶在340 nm和773 nm處各有一強吸收峰。電子順磁共振(ESR)檢測表明，酶在近中性(pH7.3)，-160℃條件下表現(xiàn)為靜默狀態(tài)。認為該蛋白是種新的膽紅素氧化酶。
　　(5)酶學(xué)特性
　　不同底物的米氏常數(shù)(Km)值分別為Km(ABTS)=1.8×10-5(mol/L)(pH3.0)

8、和Km(bilirubin）=2.7×10-5(mol/L)(pH7.5);該酶對膽紅素的最適催化活性為36℃，酶在低溫下穩(wěn)定;在高pH下可保持相當高的催化膽紅素活性;該BOD能夠耐受高濃度的硝酸鈉和尿素;低濃度的疊氮化鈉和Trisbase對酶活有促進作用而高濃度則表現(xiàn)為抑制;該酶對氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鈉、有機磷類農(nóng)藥及復(fù)合型農(nóng)藥百蟲靈、溶解氧敏感。Cu2+和Hg2+在BOD不存在的條件下，二者可氧化膽紅素為膽綠素，但產(chǎn)物不是唯一的;膽

9、紅素在BOD不存在時，可與溶液中的Li+、Na+、K+、Mn2+、Ba2+、Co2+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Ca2+絡(luò)合形成配合物，結(jié)合后的膽紅素不能被酶催化。結(jié)合該酶的酶學(xué)及光譜學(xué)特性說明此酶為一新的膽紅素氧化酶。
　　(6)電化學(xué)特性及應(yīng)用
　　通過循環(huán)伏安法研究了BOD吸附在經(jīng)羧基化的多壁碳納米微管修飾的玻碳電極上的循環(huán)伏安曲線，表明在空氣飽和的5mM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系(pH7.3)中，獲得了表觀電勢|

10、ΔEP|=107 mV(vs.SCE)，|iPa/iPc|=0.7，證明體系發(fā)生了準可逆氧化還原反應(yīng)，說明B.australiensis HD-1 BOD與玻碳電極間發(fā)生了異源電子直接轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。利用羧基化的多壁碳納米微管及Nafion膜溶液可有效增加玻碳電極的表面積，提高了吸附在電極上的酶量和電化學(xué)信號，延長了酶電極的使用時間，便于酶的直接電子轉(zhuǎn)移。用該電極通過LSV法可快速地檢測血樣中微量葡萄糖濃度(0～15μM)，且可信度較高，為該