BI-1對紫外光誘發(fā)飛廉懸浮細(xì)胞凋亡和黃酮合成積累的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、制約藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重要次生代謝產(chǎn)物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸主要有兩點：一是藥用植物細(xì)胞生長緩慢，生物量低；二是培養(yǎng)細(xì)胞的次生產(chǎn)物合成的產(chǎn)量很低。研究探討藥用植物細(xì)胞次生產(chǎn)物合成途徑調(diào)控機制對解決植物培養(yǎng)細(xì)胞次生物質(zhì)的低產(chǎn)問題具有重要理論和實際指導(dǎo)意義。次生產(chǎn)物是藥用植物在長期進(jìn)化中適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物，在環(huán)境脅迫條件下，藥用植物會產(chǎn)生具有保護(hù)作用的次生產(chǎn)物來提高環(huán)境適應(yīng)力，因此利用逆境脅迫來誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物合成是提高植物次生代謝產(chǎn)物的一個

2、重要方法。 逆境脅迫對藥用植物品質(zhì)(次生物質(zhì)合成積累)和產(chǎn)量有著雙重影響，即逆境對產(chǎn)量和品質(zhì)有雙刃劍作用，而這種矛盾通過普通的栽培和管理措施是難以協(xié)調(diào)和解決的。BI-1基因是一個對細(xì)胞凋亡有廣泛抑制作用的因子，可以抑制由Bax介導(dǎo)或非Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。為了研究探討B(tài)I-1基因?qū)δ婢痴T發(fā)藥用植物細(xì)胞凋亡和次生產(chǎn)物合成的影響，本文以本實驗構(gòu)建保存的轉(zhuǎn)BI-1基因飛廉細(xì)胞(Est誘導(dǎo)型啟動子)為材料，研究了BI-1基因表達(dá)對U

3、V誘發(fā)飛廉細(xì)胞凋亡和次生產(chǎn)物合成的影響，并探討了UV誘發(fā)飛廉細(xì)胞凋亡和次生產(chǎn)物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理，為從分子水平上協(xié)調(diào)逆境影響中藥材品質(zhì)和產(chǎn)量的矛盾提供新的思路和策略。主要實驗結(jié)果如下： (1)轉(zhuǎn)BI-1基因飛廉懸浮細(xì)胞系的建立 將固體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)BI-1基因飛廉細(xì)胞接種到MS培養(yǎng)液中，為獲得穩(wěn)定且最優(yōu)生長和黃酮類次生產(chǎn)物含量較高的培養(yǎng)條件，對培養(yǎng)液組成成分、pH值、蔗糖濃度、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量等條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了飛

4、廉懸浮細(xì)胞最適的培養(yǎng)條件：培養(yǎng)液為MS+1×10-5 mol·L-1 NAA+2×10-6mol·L-1 BA+3％蔗糖，-pH為5.8，培養(yǎng)溫度25℃，搖床轉(zhuǎn)速110 rpm，接種量為3 g/50mL medium。且飛廉細(xì)胞生長周期為14 d。在優(yōu)化培養(yǎng)過程中，定期對飛廉懸浮細(xì)胞進(jìn)行PCR驗證及抗生素篩選，經(jīng)過多次傳代，獲得分散性較好、生長較快且黃酮類次生產(chǎn)物含量較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)BI-1基因飛廉懸浮細(xì)胞系。 (2)UV脅迫誘發(fā)飛廉

5、細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成 UV脅迫處理的飛廉細(xì)胞經(jīng)Sytox特異性核酸染色觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且隨著時間的延長，細(xì)胞死亡率逐漸增高，在UV脅迫后第36 h熒光下觀察到染色質(zhì)凝聚現(xiàn)象，第72h觀察到染色質(zhì)基本成彌散狀等形態(tài)學(xué)上典型的細(xì)胞凋亡特征現(xiàn)象，而對照組細(xì)胞在熒光下無成像。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果也表明，UV脅迫處理飛廉細(xì)胞后第48 h出現(xiàn)DNA片段化，表現(xiàn)為明顯的DNA ladder現(xiàn)象，而對照組則為一條明顯的主帶。這

6、些結(jié)果都表明UV脅迫誘發(fā)了飛廉細(xì)胞凋亡。 對處于生長周期不同階段的飛廉細(xì)胞進(jìn)行UV脅迫處理，發(fā)現(xiàn)飛廉細(xì)胞生長對數(shù)期(第11 d)為UV脅迫促進(jìn)飛廉細(xì)胞黃酮類次生產(chǎn)物合成積累的最佳時期，第14 d收獲的細(xì)胞鮮重達(dá)到對照的93.8％，黃酮類次生產(chǎn)物含量達(dá)到了對照的2.69倍，表明UV脅迫可以誘發(fā)飛廉細(xì)胞黃酮類次生產(chǎn)物的合成積累。 (3)NO參與介導(dǎo)UV脅迫誘導(dǎo)飛廉細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成 為了探討UV脅迫誘導(dǎo)飛廉

7、細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理，本文測定了UV處理后飛廉細(xì)胞中NO的含量。數(shù)據(jù)顯示，UV脅迫處理后10 h，飛廉細(xì)胞中NO含量開始出現(xiàn)增加，并在18 h出現(xiàn)第一次高峰，隨后有所下降，在處理后第32 h出現(xiàn)第二次躍遷，NO含量在第38 h達(dá)到第二個高峰，且第二次進(jìn)發(fā)的NO含量高于第一次，表明UV脅迫誘發(fā)飛廉細(xì)胞內(nèi)的NO進(jìn)發(fā)。通過添加NO淬滅劑cPITO發(fā)現(xiàn)，在NO被清除的同時UV脅迫誘導(dǎo)的飛廉細(xì)胞凋亡受到抑制，黃酮類次生產(chǎn)物合

8、成亦受到一定程度的抑制。表明NO同時參與UV脅迫誘發(fā)的飛廉細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成調(diào)控途徑。 (4)BI-1基因表達(dá)對UV脅迫誘導(dǎo)飛廉細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成積累的影響 Western blotting檢測結(jié)果表明，添加20μmol·L-1雌二醇(Est)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)BI-1基因飛廉細(xì)胞中BI-1的穩(wěn)定表達(dá)。實驗結(jié)果顯示Est誘導(dǎo)BI-1基因表達(dá)對正常培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)基因飛廉細(xì)胞無影響，與野生型飛廉細(xì)胞在細(xì)胞生長和

9、黃酮類次生產(chǎn)物合成積累上也沒有明顯區(qū)別。而在UV脅迫前添加Est誘導(dǎo)BI-1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BI-1基因表達(dá)對UV脅迫誘發(fā)的細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，但對UV脅迫誘發(fā)的黃酮類次生產(chǎn)物合成和NO積累沒有影響。表明NO可能依賴不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分別參與UV脅迫誘導(dǎo)飛廉細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物合成。 綜上所述，本文實驗結(jié)果表明：(1)UV處理可以分別誘發(fā)飛廉細(xì)胞凋亡和黃酮類次生產(chǎn)物的合成積累；(2)NO同時參與UV脅迫誘發(fā)飛廉細(xì)胞凋亡和