DNA凝聚過程中溶劑效應的單分子研究.pdf

1、DNA的凝聚是分子生物學的核心之一，而單分子操縱技術在分子生物學的發(fā)展中提供重要的手段，本文主要是采用單分子磁鑷技術(MT)與原子力顯微鏡技術(AFM)，對DNA的凝聚過程的溶劑效應進行研究。主要研究內容包括:
　　1.利用原子力顯微鏡技術(AFM)，系統(tǒng)地研究了由乙醇與多價離子(hexammine cobalt(Ⅲ)[Co(NH3)6<'3+>])協(xié)同作用導致的lambda-DNA凝聚現(xiàn)象。單獨測得三價Co(NH3)6<'3+>

2、的臨界凝聚濃度大約是10μM，乙醇的臨界凝聚濃度大約是15％(v/v)。若三價離子Co(NH3)6<'3+>的濃度大于400μM時，可以觀察到DNA的解凝聚現(xiàn)象。在DNA溶液中同時36加入乙醇(12％)與Co(NH3)6<'3+>(8μM)，當其濃度各低于臨界值時，也可觀察到凝聚現(xiàn)象，說明乙醇與Co(NH3)6<'3+>對DNA的凝聚有協(xié)同作用。而且在協(xié)同作用下，可以觀察到典型的36圓環(huán)結構(toroids)。其中解凝聚現(xiàn)象可能運用電荷

3、逆轉與離子釋放機制來解釋。
　　2.通過AFM與MT的技術，研究酒精導致的DNA凝聚。酒精一般被用作提純DNA的沉淀劑，我們通過MT與 AFM技術研究酒精導致的單分子 DNA凝聚。首次證明酒精引起的DNA塌縮的中間亞穩(wěn)球拍態(tài)的存在。對于凝聚力的測量，甚至在50％酒精濃度都不到0.2pN，這個值遠遠小于多價離子與表面活性劑。還證明了酒精導致的DNA形態(tài)的B-A轉變，發(fā)現(xiàn)DNA的A形態(tài)的彈性模量比B形態(tài)的要大。與多價離子相比，酒精導致

4、DNA凝聚的拉伸實驗表現(xiàn)了不同的特性，其拉伸曲線的步長范圍比較大，從幾十納米到幾微米的范圍都有，與多價離子相對統(tǒng)一的200nm的步矩形成對比。同時我們發(fā)現(xiàn)，隨著酒精濃度的增加，DNA的持久長度成單調減小的趨勢。在弱溶劑里，由于DNA片段之間的弱相互作用引起的DNA的凝聚形態(tài)，多是一些不規(guī)則球拍組成的松散花狀的結構。通過AFM成像進一步證實這些現(xiàn)象與分析結果。得出結論，在酒精導致的DNA凝聚中溶劑排斥效應比電荷中和效應更占據(jù)主導地位。

5、r>　　3.多個識別位點的內切酶與 DNA相互作用的方式有很多，其中通過結合成環(huán)狀的方式在許多基礎生物化學的過程中起著很重要的作用。限制性內切酶 BspMI必須綁定 DNA上面兩個有效的識別位點才具有有效的活性，這是研究這種成環(huán)相互作用的有用模型。在實驗中Ca2+代替正常的內切酶輔助因子 Mg2+，限制了內切酶的切割作用，導致內切酶與 DNA的結合，而且這種內切酶一般是通過四聚體的形式與 DNA的一個位點結合或者通過一個四聚體結合兩個位