血中乙醇和膽汁酸分析方法的建立及臨床應用.pdf

1、建立靈敏、簡單、可用于血液中生物活性物質(zhì)測定的分析方法是臨床檢驗診斷學學科發(fā)展的重要方向之一。電化學分析法靈敏、快速，且所用儀器簡單、易于微型化，在臨床疾病的輔助診斷和標志物的快速檢測中扮演著重要角色。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術具有靈敏度高、結果準確且重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可實現(xiàn)血液中已知和未知的多種代謝物同時檢測。鑒于此，本文以氧化/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+/NADH）為基礎，建立了簡單、實用的血液中乙醇和總膽汁酸（total b

2、ile acid，TBA）的電化學分析方法；并采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-TripleTOF-MS/MS）技術對妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥（intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）和妊娠期無癥狀高膽汁酸血癥（asymptomatic hypercholanaemia of pregnancy，AHP）患者血清膽汁酸代謝輪廓進行全面分析。主要內(nèi)容包括以下四個部分：
　　1.免

3、修飾絲網(wǎng)印刷碳電極（SPCE）-電化學測定血漿乙醇方法的建立及應用。利用乙醇脫氫酶（ADH）和NAD+特異性催化乙醇生成乙醛和NADH的氧化-還原體系，采用SPCE并結合直接稀釋血液的策略，實現(xiàn)血漿中乙醇的電化學測定。血漿樣本經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋后與ADH和NAD+室溫共反應，再滴加到SPCE表面，采用示差脈沖伏安法（DPV）進行測定。該方法線性良好（0.10～3.20mg/mL，r=0.9943），靈敏度較高（LOD，40.0

4、μg/mL）。精密度和回收率分別為（RSD，5.1%～9.4%）和（80.1%～103%）。將建立的方法用于20例飲酒自愿者血漿乙醇的測定并與氣相色譜（GC）法測定結果比較，相關性良好（r=0.9311）。該方法簡單、準確，有望用于酒精中毒、酒駕和醉駕等的快速篩查。
　　2.基于雙重氧化的血清TBA超靈敏電化學傳感器的構建及臨床應用。含3α羥基類固醇脫氫酶（3α-HSD）、NAD+和三聯(lián)吡啶釕（Ru(bpy)32+）的PBS溶液滴

5、加到SPCE電極表面并施加恒電位，加入稀釋血樣，3α-HSD特異性催化血清中膽汁酸生成 NADH，NADH與被氧化的Ru(bpy)33+反應生成Ru(bpy)32+，Ru(bpy)32+再被氧化為Ru(bpy)33+產(chǎn)生電化學信號，采用計時電流法測定，實現(xiàn)血清TBA超靈敏檢測。該方法測定血清 TBA的線性良好（5.0～150.0?mol/L，r=0.9983），靈敏度較高（LOD，0.40?mol/L）。精密度和回收率分別為（RSD，6

6、.4%～11.8%）和（91.4%～108%）。將建立的方法用于正常孕婦（20例）、ICP患者（30例）和AHP患者（22例）血清樣本測定并與酶循環(huán)法測定結果比較，相關性良好（r=0.9372）。與正常孕婦相比，ICP與AHP患者血清TBA均顯著增高。該方法靈敏、快速有望用于床旁檢測。
　　3. AHP與ICP患者血清膽汁酸代謝輪廓分析。利用UPLC-TripleTOF-MS/MS對27例正常孕婦、26例AHP患者和59例ICP患

7、者血清中57種膽汁酸的代謝輪廓進行分析。采用PLS-DA顯示AHP患者的血清膽汁酸代謝輪廓與正常孕婦和 ICP孕婦均具有明顯差異，VIP值>1的24種膽汁酸，其中甘氨脫氧膽酸（GDCA）、?；侨u基膽汁酸的同分異構體4（Ttri-4）、?；?ω-鼠膽酸（T-ω-MCA）、甘氨豬膽酸（GHCA）、甘氨三羥基膽汁酸同分異構體3（Gtri-3）這5種膽汁酸在三組間均有顯著差異（P＜0.05）。采用Logistic回歸篩選出疾病組（AHP和IC

8、P）與正常組的聯(lián)合診斷標志物甘氨膽酸（GCA）、甘氨三羥基膽汁酸同分異構體1（Gtri-1）和?；嵌u基膽汁酸同分異構體1（Tdi-1），ROC曲線下面積（AUC）為0.989，靈敏度98.9%，特異性100%；鑒別AHP與ICP的聯(lián)合診斷標志物石膽酸（LCA）、Gtri-1和鵝脫氧膽酸（CDCA），AUC為0.956，靈敏度92.1%，特異性91.7%。膽汁酸代謝輪廓分析與成分膽汁酸的檢測有助于臨床對AHP的認識，診斷與鑒別診斷。

9、r>　　4.芯片-電化學法檢測血清TBA的方法學研究。固相萃取（SPE）預處理的血清樣本經(jīng)聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）芯片通道電驅(qū)動進樣后電泳到檢測池，血清膽汁酸與檢測池中的3α-HSD、Ru(bpy)32+和NAD+發(fā)生酶促偶聯(lián)-雙重氧化還原反應，生成的Ru(bpy)32+在SPCE電極上被氧化產(chǎn)生電信號，采用計時電流法進行分析。該方法測定血清TBA的線性良好（1.0～100.0?mol/L，r