高效毛細(xì)管電泳在基因突變分析中的方法學(xué)及應(yīng)用研究.pdf

1、基因突變與腫瘤發(fā)生有著較高的相關(guān)性，所以探索研究新的、靈敏度高的檢測(cè)基因突變的方法是相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜夜餐P(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，也是交叉學(xué)科。檢測(cè)基因突變的經(jīng)典及常用的分子生物學(xué)方法有多種，如瓊脂糖和聚丙烯酰胺電泳方法，其中分析基因雙鏈的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)與分析基因單鏈的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)技術(shù)較為常用。RFLP和SSCP方法檢測(cè)靈敏度低，陽(yáng)性檢測(cè)率高，但隨著與高效毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)合在分子生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用，它們具備了檢測(cè)靈敏度

2、高、分離度高和檢測(cè)效率高的特點(diǎn)。探索毛細(xì)管電泳技術(shù)在檢測(cè)基因突變的方法，可為腫瘤的準(zhǔn)確診斷和預(yù)警提供更為科學(xué)的技術(shù)和方法。本論文以此為目的探索建立了一套可靠完整的適用于RFLP及SSCP技術(shù)的毛細(xì)管電泳分析分離體系用于腫瘤基因突變檢測(cè)，并探討了相關(guān)的分離機(jī)理，為更進(jìn)一步將此技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷提供理論基礎(chǔ)。 本論文共分3個(gè)部分，第一部分毛細(xì)管電泳在腫瘤分析中的研究進(jìn)展，第二部分是基于基因雙鏈RFLP技術(shù)的雙鏈DNA毛細(xì)管電泳體系的

3、建立及其分離機(jī)理的研究和第三部分基于基因單鏈SSCP技術(shù)的單鏈DNA毛細(xì)管電泳體系的建立及其分離機(jī)理的研究。 第一部分研究進(jìn)展，主要綜述了腫瘤相關(guān)物及基因突變分析的研究進(jìn)展，腫瘤相關(guān)物研究進(jìn)展包括癌基因、抑癌基因及腫瘤標(biāo)志物三方面，基因突變分析進(jìn)展則主要集中在包括SSCP和RFLP等方法的應(yīng)用研究上。 第二部分雙鏈DNA毛細(xì)管電泳體系的建立及其分離機(jī)理的研究，目的是為了建立基因雙鏈分離體系，以自制線性聚丙烯酰胺為分離介質(zhì)

4、并結(jié)合自己修飾的涂層毛細(xì)管柱，建立了分離pBR322/BsuRI的雙鏈分離體系，方法是系統(tǒng)研究了SLPA濃度、溫度、分離電壓、甘露醇添加劑、pH等因素對(duì)雙鏈DNA分析的影響。結(jié)果表明：①SLPA濃度提高，DNA的分離度先提高后降低，在6％時(shí)能夠達(dá)到對(duì)pBR322/BsuRI各片段的最佳分離；②溫度在25℃，分離電壓在13kV時(shí)為最佳條件，電壓升高會(huì)降低分離度，使出峰時(shí)間縮短；③甘露醇與分離介質(zhì)中硼酸反應(yīng)而改變了分離介質(zhì)的特性，降低了pH

5、，從而提高雙鏈DNA的分離效果，最佳濃度為8％；④pH降低進(jìn)樣量有所提高，峰寬變窄，對(duì)分離度的提高不如加入甘露醇的效果好。本分離體系最終可以達(dá)到同時(shí)分離20bp-600bp的雙鏈DNA，符合RFLP分析基因突變的要求。同時(shí)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明DNA在該分離體系中電泳淌度的常用對(duì)數(shù)與SLPA濃度呈線性關(guān)系，結(jié)果P＜0.01，證明分離機(jī)理屬于Ogston模型，并以DNA堿基數(shù)為自變量，遷移時(shí)間為變量得出一個(gè)三相式方程，p＜0.0001，R2=0.9

6、99，經(jīng)考察證實(shí)此方程與實(shí)際電泳情況非常吻合并能對(duì)RFLP的內(nèi)切酶選擇做參考指導(dǎo)。 第三部分單鏈DNA毛細(xì)管電泳體系的建立及其分離機(jī)理的研究，目的是建立單鏈DNA分離體系，方法是首次建立pBR322和pUC19中的氨芐抗性基因?yàn)閱吸c(diǎn)基因突變模型，以該模型為分離對(duì)象分別考察了SLPA濃度、溫度、分離電壓對(duì)單鏈分離的影響，結(jié)果表明：①溫度在分離單鏈DNA時(shí)起到?jīng)Q定性作用，其最佳分離溫度為19℃；②該模型的最佳分離SLPA濃度是6％。

7、經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)實(shí)際電泳中的4個(gè)單鏈峰分別屬于pBR322和pUC19的氨芐抗性基因中，結(jié)果表明模型建立合理，單鏈分離體系可靠，本體系可用于腫瘤基因突變分析中，同時(shí)由于該模型序列已知、設(shè)計(jì)合理，可用來(lái)對(duì)其它單鏈分離體系進(jìn)行考察如不同的分離介質(zhì)體系。MFOLD軟件常用以預(yù)測(cè)核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)輔助設(shè)計(jì)反義核酸藥物，本論文用MFOLD軟件目的是預(yù)測(cè)單鏈DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并看它是否與電泳遷移時(shí)間有相關(guān)性。結(jié)果只預(yù)測(cè)出3種不同結(jié)構(gòu)，與實(shí)際電泳中出現(xiàn)的4個(gè)峰不一