兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157-H7.pdf

1、分類號：O657.3密級：公開UDC：學號：407304714055南昌大學碩士研究生學位論文兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測單核增生李斯兩種新型酶聯(lián)免疫分析法超靈敏檢測單核增生李斯特菌和大腸桿菌特菌和大腸桿菌O157:H7TwoNovelEnzymelinkedImmunosbentAssayftheUltrasensitiveDetectionofListeriamonocytogenesEscherichiacoliO157:H7

2、陳銳培養(yǎng)單位（院、系）：生命科學學院中德聯(lián)合研究院、食品科學與技術國家重點實驗室指導教師姓名、職稱：熊勇華博士、研究員許恒毅博士、副研究員申請學位的學科門類：理學學科專業(yè)名稱：生物化學與分子生物學論文答辯日期：2017年5月27日答辯委員會主席：評閱人：2017年5月27日摘要II摘要酶聯(lián)免疫分析技術（Enzymelinkedimmunosbentassay，ELISA）是基于免疫酶技術發(fā)展的一種非放射性免疫標記分析技術，其中基于辣根過

3、氧化物酶（Hseradishperoxidase，HRP）催化底物產(chǎn)生顯色信號的常規(guī)ELISA方法檢測靈敏度相對較低，而基于新型信號輸出的高靈敏ELISA是當前分析化學領域的研究熱點。食源性致病菌是一種以肉制品、蛋制品、水產(chǎn)品、果蔬及乳制品等生鮮食品為傳播媒介，隨食物攝入人體或動物消化道后釋放致病因子引起中毒的致病性細菌。食源性致病菌造成的食品污染問題已成為食品安全的主要問題之一，因食源性致病菌引起的食源性疾病占食品中毒事件的30%－9

4、0%。因此，建立簡單、快速且靈敏的食源性致病菌特異性檢測方法對于控制食源性致病菌污染具有重要意義。本研究探討了基于過氧化氫酶（Catalase，CAT）介導的兩種新型ELISA提高單核增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes，L.monocytogenes）和大腸桿菌O157:H7（EscherichiacoliO157:H7，E.coliO157:H7）檢測靈敏度的可行性及理論依據(jù)。首先研究了基于CAT介導的金納米粒子

5、可控生長的表面等離子共振ELISA（PlasmonicELISA，pELISA）建立了超靈敏檢測L.monocytogenes的新方法。該研究以二氧化硅（Silicondioxide，SiO2）納米顆粒為載體，通過可逆加成－斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合方法在SiO2納米顆粒表面修飾聚丙烯酸分子刷（PAA），以此作為CAT的“集裝箱”提高酶的載量，通過生物素（Biotin）－鏈霉親和素（Streptavidin，SA）系統(tǒng)將SiO2@PAA@CA

6、T復合物引入ELISA。當檢測體系中存在L.monocytogenes時，雙氧水被消耗，氯金酸被還原形成粒徑不規(guī)則的納米粒子，溶液呈藍色；當檢測體系中不存在L.monocytogenes時，足量的雙氧水還原氯金酸形成規(guī)則的球形金納米粒子，溶液呈紅色。依據(jù)該原理，建立了檢測L.monocytogenes的曲線回歸方程：y=?0.015Log(x)?0.2057（R2=0.985），定量檢測范圍為8100CFUmL至8106CFUmL。檢測

7、PBS（0.01M，pH7.4）中L.monocytogenes的最低檢測限（LOD）為8101CFUmL，較傳統(tǒng)的ELISA提高了5個數(shù)量級。當L.monocytogenes加標濃度分別為8100、8101、8102和8103CFUg時，該方法的回收率分別為5012.5%、101%22.6%、68.3%6.13%和76.8%21.8%；當加標濃度為8100CFUg，將1mL稀釋液等分成10等份全部用pELISA檢測，pELISA的檢測