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文檔簡介
1、生物乙醇吸引越來越多的關(guān)注和應(yīng)用,主要原因是它作為可再生液體交通燃料,既可緩解石油能源危機(jī),也可減少溫室氣體排放。生物乙醇即可以單獨(dú)或與汽油混配制成乙醇汽油作為汽車燃料。生物乙醇燃料燃燒所排放的二氧化碳(CO2)約等于生產(chǎn)乙醇所用生物質(zhì)吸收的CO2,CO2凈排放等于零。生物乙醇可用不同類型的可再生原料采用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn),第1代原料-甘蔗、玉米、小麥、木薯和甜高粱等,第2代原料-木質(zhì)纖維素生物質(zhì),第3代原料-藻類生物質(zhì)。針對(duì)木薯乙醇和
2、纖維素乙醇中存在的問題,我們從三個(gè)角度進(jìn)行研究和改進(jìn)工藝或菌種:1)通過采用和優(yōu)化降粘酶來完成木薯濃醪發(fā)酵;2)基于CO2固定構(gòu)建可高效代謝木糖的工程釀酒酵母;3)構(gòu)建可直接發(fā)酵纖維素和木糖的工程釀酒酵母。
發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度越高,生產(chǎn)燃料乙醇精餾和脫水工段將節(jié)省更多能量。初始醪液濃度決定了發(fā)酵終點(diǎn)乙醇濃度,而木薯的高粘度特性限制了初始木薯醪液的濃度。最簡單的方法是玉米和木薯聯(lián)合發(fā)酵,當(dāng)玉米占比達(dá)40%以上時(shí),乙醇濃度可達(dá)到10
3、9.3 g·L-1,乙醇得率達(dá)到87%以上,分別比單獨(dú)木薯發(fā)酵時(shí)高9.4%和11%。為了完成木薯濃醪發(fā)酵,我們?cè)诎枇想A段和發(fā)酵階段采用降粘酶進(jìn)行降粘,優(yōu)化的拌料階段降粘酶配方為:液化酶12U·g-1,纖維素酶10 U·g-1,木聚糖酶5U·g-1,酸性果膠酶8 U·g-1;優(yōu)化的同步糖化發(fā)酵階段降粘酶配方:糖化酶150 U·g-1,普魯蘭酶0.08 U·g-1,酸性蛋白酶10 U·g-1,纖維素酶10 U·g-1,木聚糖酶5U·g-1。
4、采用同步糖化發(fā)酵方式,當(dāng)發(fā)酵38%(w·v-1)木薯醪液時(shí),原料淀粉利用率達(dá)到94.47%,終點(diǎn)乙醇濃度達(dá)到140 g·L-1,平均乙醇生產(chǎn)速率達(dá)到2.86 g·L-1·h-1。降粘酶的添加增加了酶投入成本,而原料出酒率的提高減少木薯原料的使用,使得總投入成本降低。
木質(zhì)纖維素水解液中的第二大糖類-木糖由于不能有效地釀酒酵母轉(zhuǎn)化為乙醇而阻礙了纖維素乙醇的商業(yè)化應(yīng)用。首先,我們通過在Saccharomyces cerevisia
5、eYS58聯(lián)合表達(dá)外源的木糖還原酶(xylosereductase,XR)基因XYL1,突變木糖還原酶[XR(R276H)]基因mXYL1,木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因XYL2和內(nèi)源的木酮糖激酶(xylulokinase,XK)基因XKS1獲得了工程酵母YSX4,實(shí)現(xiàn)了釀酒酵母對(duì)木糖的利用。YSX4發(fā)酵木糖和葡萄糖時(shí)木糖消耗速率為0.57g·L-1·h-1,而發(fā)酵木糖和麥芽糖時(shí)木糖消耗速率為0.
6、7g·L-1·h-1,糖的同步消耗有助于木糖代謝。進(jìn)一步,我們?cè)赮SX4上聯(lián)合表達(dá)核酮糖-1,5-2P羧化酶[Form-Ⅱ ribulose bisphosphatecarboxylase-oxygenase(Rubisco)]基因cbbM,磷酸核酮糖激酶(phosphoribulokinase,PRK))基因sPRK和分子伴侶(chaperone)基因GroEL-GroES構(gòu)建了形式-Ⅱ的CO2固定系統(tǒng),獲得工程酵母YSX4C111;
7、或聯(lián)合表達(dá)來自Ralstonia eutropha H16的Form-Ⅰ Rubisco基因cbbL1-cbbS1,PRK基因cfxP1和S.cerevisiae內(nèi)源chaperone基因HSP60-HSP10構(gòu)建了形式-Ⅰ CO2固定系統(tǒng),獲得工程酵母YSX4C222。當(dāng)發(fā)酵麥芽糖和木糖時(shí),YSX4C111和YSX4C222的木糖消耗速率分別達(dá)到0.97 g·L-1·h-1和1.1 g·L-1·h-1。YS X4C222總糖消耗速率和
8、總乙醇得率為3.1 g·L-1·h-1和0.47 g·g-1,分別比對(duì)照菌YSX4C000高63%和15%。測得YSX4C222的Rubisco胞外羧化酶活性也最高。我們?cè)u(píng)估不同時(shí)間段的相對(duì)CO2通量,約8%來自木糖的核酮糖通過CO2途徑被轉(zhuǎn)化為乙醇。通過計(jì)算工程酵母的CO2固定速率,YSX4C111和YSX4C222的平均CO2固定速率分別達(dá)到336.6和436.3 mg·L-1·h-1,遠(yuǎn)高于自然的或工程化的可固定CO2微生物的CO
9、2固定速率(5.8-147.0 mg·L-1·h-1)。
可發(fā)酵糖和纖維素整合工藝(Consolidated bioprocessing,CBP)對(duì)于利用菌株以纖維素為底物發(fā)酵產(chǎn)乙醇是最有前景的選擇。我們通過代謝工程和基因工程手段實(shí)現(xiàn)工程S.cerevisiae在有限接種條件下聯(lián)合發(fā)酵纖維素和蔗糖或木糖?;谥皹?gòu)建的半乳糖和纖維素聯(lián)合發(fā)酵菌株,我們首先用組成型啟動(dòng)子替換了纖維小體表達(dá)和組裝的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。構(gòu)建的工程菌EBY1
10、01-CC在聯(lián)合發(fā)酵羧甲基纖維素(Carboxy Methylated Cellulose,CMC)和蔗糖時(shí),以蔗糖分批補(bǔ)料方式進(jìn)行發(fā)酵,10 g·L-1 CMC能完全被消耗且生產(chǎn)4.3 g·L-1乙醇,總乙醇得率為0.43 g·g-1。在此菌株基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建木糖代謝途徑和強(qiáng)化纖維素降解功能,獲得的工程菌EBY101-X5CC和EBY101-X5CP分別發(fā)酵木糖和CMC或磷酸膨脹纖維素(phosphoric acid-swollen
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