蛋白折疊液相色譜法用于對還原變性牛胰島素折疊行為的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、高效液相色譜不僅用于生物大分子的分離,也是蛋白折疊研究的重要手段,已發(fā)展成為蛋白折疊液相色譜法。本文利用疏水色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜分別對還原變性牛胰島素進行了折疊研究,采用反相色譜、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI—TOF MS)及光譜學(xué)方法對折疊后的組分進行分離和檢測。 本文在綜述部分對蛋白復(fù)性的原理、蛋白復(fù)性的方法進行了闡述和比較,以及LC對蛋白復(fù)性的貢獻(xiàn)和二硫鍵的折疊研究方面的進展做了全面的概述,并

2、簡要介紹了本研究的目的及研究策略。 首先利用疏水色譜法(HIC)對還原變性牛胰島素的折疊行為進行了研究,詳細(xì)研究了流動相中脲濃度、谷胱甘肽氧化還原劑對對還原變性胰島素折疊行為的影響。發(fā)現(xiàn)復(fù)性流動相中加入低濃度的脲能夠有效抑制還原變性胰島素的聚集沉淀,而GSH/GSSG的加入能夠參與二硫鍵的對接反應(yīng)。但是通過MALDI—TOF MS檢測發(fā)現(xiàn),由于GSH、GSSG修飾到胰島素的兩條多肽鏈上,使胰島素鏈間二硫鍵的對接反應(yīng)受到了影響,復(fù)

3、性效率提高不明顯。通過脲濃度及GSH/GSSG條件的優(yōu)化,還原變性胰島素復(fù)性后的質(zhì)量回收率從普通流動相時的零提高到3.5%。另外,研究了不同疏水強度的疏水柱(疏水端基分別為PEG-200、PEG-400、PEG-600、PEG-800、PEG-1000)對還原變性牛胰島素復(fù)性的影響,以疏水強度適中的PEG-600效果最好。最后對還原變性牛胰島素在HIC色譜上的動力學(xué)行為進行了研究。實驗表明還原變性胰島素在柱子上的停留時間對其折疊行為有影

4、響,隨著時間的延長,復(fù)性效率有所提高,但效果不明顯。 然后利用離子交換色譜法(IEC)對還原變性牛胰島素的折疊行為進行了研究,采用弱陰離子交換色譜法(WAX)對還原變性胰島素的折疊行為進行了研究??疾炝肆鲃酉嘀须鍧舛?、不同氧化還原體系( GSH/GSSG、Cyst/GSSG、Cyst)及不同氧化還原劑對的濃度比率對還原變性胰島素復(fù)性的影響。當(dāng)流動相中添加3 mol/L的脲以及濃度比例為6:1的Cyst/GSSG時,還原變性胰島素

5、的復(fù)性效果最好,質(zhì)量回收率達(dá)到了10.6%。另外,本章還研究了WAX采用線性脲梯度洗脫的方式時對還原變性胰島素折疊的影響。通過不同梯度的選擇,復(fù)性后胰島素的質(zhì)量回收率提高到了13.3%。最后,同時采用氧化還原劑及脲梯度對IEC復(fù)性還原變性胰島素進行了研究,質(zhì)量回收率進一步提高,此時達(dá)到了15.6%,并且通過質(zhì)譜與光譜的檢測,發(fā)現(xiàn)在此過程中形成了分子量與天然胰島素相同但是RPLC上保留時間不同的穩(wěn)定的中間體,此中間體的質(zhì)量回收率為17.9

6、%,所以在此條件下,胰島素二硫鍵的正確對接率達(dá)到了33.5%。 最后,利用了體積排阻色譜法(SEC)對還原變性牛胰島素的折疊行為進行了研究,首先對非氧化型流動相的SEC法和氧化型流動相的SEC法復(fù)性還原變性胰島素分別進行了研究,發(fā)現(xiàn)非氧化型SEC幾乎不能使還原變性胰島素得到復(fù)性,而添加了濃度比為6:1的Cyst/GSSG后,還原變性胰島素復(fù)性后的質(zhì)量回收率達(dá)到了4.2%。此外,利用氧化型流動相脲梯度凝膠過濾復(fù)性方法對還原變性胰島

7、素的復(fù)性進行了研究,發(fā)現(xiàn)胰島素的復(fù)性效率并沒有明顯提高,大量的胰島素A鏈和B鏈分別與流動相中的小分子結(jié)合,使復(fù)性回收率的提高受到了限制。在本章中還對以上三種不同的蛋白折疊液相色譜法復(fù)性還原變性胰島素進行了比較,以IEC法效果最佳,而HIC的效果是最差的。并對導(dǎo)致胰島素復(fù)性效率低的原因做了比較詳細(xì)的討論。 本文分別利用疏水色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜分別對還原變性牛胰島素的折疊行為進行了研究,并考察了多種影響因素對其二硫鍵正確

8、對接的影響。如流動相中的脲濃度、固定相、不同氧化還原體系、動力學(xué)影響、脲梯度等。利用弱陰離子交換色譜法在最優(yōu)化條件下可使還原變性牛胰島素的二硫鍵對接率由2.6%提高到33.5%。本研究還為還原變性的雙鏈蛋白的折疊建立了一種新的檢測方法,尤其是對于生物活性檢測受到限制的蛋白,利用MALDI—TOF MS檢測其分子量,便能得出雙鏈蛋白鏈間的二硫鍵是否配對,再結(jié)合光譜法即可判斷出折疊后的蛋白是否恢復(fù)到了其天然態(tài)構(gòu)象。這種檢測方法既具有操作簡單

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