一分鐘整體蛋白液相色譜法的建立.pdf

1、蛋白質(zhì)組學、蛋白藥物和來自動植物等天然產(chǎn)物中的蛋白的分離和純化的研究都需要液相色譜法快速分離技術。PeterCarr小組最近提出快速分離的目標：一維液相色譜分離要在1～10min內(nèi)完成，二維液相色譜分離要在10～100min內(nèi)完成。盡管這個建議是針對多肽提出的，但是也可以作為整體蛋白快速分離的目標。在本文中，利用蛋白質(zhì)在液-固界面的不連續(xù)遷移和色譜餅這種柱技術，首次建立了一分鐘整體蛋白液相色譜法。一般的快速分離僅僅包含了蛋白分離過程，而

2、一分鐘整體蛋白液相色譜在1min內(nèi)完成分離過程和色譜餅再生過程。分別用標準蛋白檢測了反相色譜法、離子交換色譜法和疏水相互作用色譜法三種模式的一分鐘整體蛋白液相色譜法，蛋白質(zhì)分離度沒有明顯地損失。除了分離速度快分離能力強，該技術還有負載量高的優(yōu)點。
　　 論文包括了以下6個部分：
　　 1.緒論
　　 說明了色譜法快速分離的意義。介紹了一維快速分離蛋白質(zhì)的方法，包括非多孔固定相、整體固定相、灌注色譜法、高溫快速液相

3、色譜法和色譜餅法；還介紹了二維色譜快速分離蛋白質(zhì)的方法，包括了常規(guī)的使用多根不同機理色譜柱的二維液相色譜法(2D-LC)和使用一根有兩種正交分離能力色譜柱的單柱二維液相色譜法(2D-LC-1C)。
　　 2.多孔反相填料對整體蛋白的高速、高分離度和高負載量分離使用側(cè)孔裝填技術把3μm的C18反相多孔填料裝填在超薄色譜餅(1mm×10mmI.D.，78μL)中，用于7種標準蛋白混合物的分離。首次比較了小柱床體積的色譜餅和大柱床體積

4、的色譜柱(50mm×4.6mmI.D.,830μL)分離小分子和整體蛋白的效果。由于小分子在色譜柱(餅)床上的遷移是連續(xù)的，導致色譜餅分離小分子的效果遠遠差于色譜柱。而蛋白質(zhì)在液-固界面存在“粘附能”，使得蛋白質(zhì)在色譜柱(餅)床上的遷移是不連續(xù)，造成色譜餅分離蛋白質(zhì)的效果與色譜柱相當。由于色譜餅內(nèi)徑大柱長短的特殊結(jié)構(gòu)，其動力學性質(zhì)遠好于色譜柱，可以在高達10mL/min的流速下使用。在優(yōu)化條件下用色譜餅在30s內(nèi)分離了7種蛋白。在5mi

5、n內(nèi)連續(xù)5次快速分離蛋白質(zhì)。表明當固定相和蛋白質(zhì)之間的作用力是非選擇性作用力時，一分鐘整體蛋白液相色譜法是可以實現(xiàn)的。在1min內(nèi)還基線分離了總量是1mg的7種蛋白的混合物，實現(xiàn)了高速、高分離度和高負載量的“三高”效果。該方法有希望用于臨床例行分析。
　　 3.多孔弱陽離子交換填料對整體蛋白的“三高”分離：
　　 比較了兩種弱陽離子交換商品填料TSKgelCM-5PW和PolyCATA分離蛋白的效果，填料PolyCATA

6、(粒徑，3μm；孔徑，150m)更適合實現(xiàn)一分鐘整體蛋白液相色譜法。PolyCATA色譜餅(1mm×10mmI.D.)和色譜柱(50mm×4.6mmI.D.)的分離能力相當。然而，色譜餅的動力學性質(zhì)更好。在優(yōu)化的條件下，在18s內(nèi)分離了4種標準蛋白。分離速度比整體固定相和無孔填料都要快，分離效果也更好。在10min內(nèi)連續(xù)進行了10次的蛋白分離，證明了當固定相和蛋白質(zhì)之間的作用力是靜電相互作用力時，也可以實現(xiàn)一分鐘整體蛋白液相色譜法。另外

7、用PolyCATA色譜餅在1min內(nèi)快速分離了總量1mg的4種蛋白混合物。
　　 4.無孔疏水填料快速分離整體蛋白：
　　 用裝填2.5μm的無孔疏水填料的色譜餅(10mm×10mmI.D.)和色譜柱(35mm×4.6mmI.D.)來分離蛋白質(zhì)。在優(yōu)化的條件下，用色譜柱在3.5min內(nèi)可以分離7種蛋白的混合物，而使用色譜餅僅僅需要2.1min就可以完成類似的分離。色譜餅的動力學性質(zhì)更好，可以在更大的流速下分離蛋白質(zhì)，更適

8、合快速分離。盡管得到的結(jié)果大于1min，但是比較接近一分鐘整體蛋白液相色譜法的目標。
　　 5.無孔反相色譜填料對整體蛋白的“三高”分離：
　　 用裝有1.0μm無孔反相填料色譜餅(7.5mm×10mmI.D.)首次在常規(guī)色譜條件下1min分離1μg和40μg的7種標準蛋白，并且在1min內(nèi)幾乎完全分離0.5mg該7種蛋白的混合物，達到高速、高分離度和高負載的“三高”效果。開辟了用常規(guī)液相色譜儀快速分離高負載蛋白的新途徑

9、。
　　 6.多孔二維色譜(SAX-HIC)填料及其在疏水模式下的一分鐘整體蛋白色譜法：
　　 與相應模式的一維色譜填料相比，二維色譜填料有改善分離選擇性的優(yōu)點，因此合成了一種多孔強陰離子交換-疏水相互作用二維色譜(SAX-HIC)填料來改善填料在HIC模式下的分離能力。用該填料裝填的二維色譜餅(1mm×10mmI.D.)在HIC模式下分離蛋白。在5mL/min流速下1min內(nèi)不僅快速分離了6種蛋白質(zhì)，還平衡了色譜柱。其