解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)神經(jīng)酸代謝工程研究.pdf

1、神經(jīng)酸(nervonic acid)是大腦神經(jīng)細胞和組織中的一種天然成分，也是世界公認的具有修復(fù)疏通受損大腦神經(jīng)通路、恢復(fù)神經(jīng)末梢活性、促進神經(jīng)細胞生長和發(fā)育功能的重要物質(zhì)。為此，神經(jīng)酸已然成為預(yù)防和治療大腦相關(guān)疾病的最佳選擇。
　　自然界中神經(jīng)酸來源稀少，遠遠不能滿足市場對其的需求。本文通過基因工程技術(shù)對解脂耶羅維亞酵母（yarrowia lipolytica）代謝途徑進行改造，獲得了產(chǎn)神經(jīng)酸的解脂耶羅維亞酵母工程菌株。具體研究

2、結(jié)果如下:
　　(1)通過同源重組技術(shù)敲除URA3基因，獲得了解脂耶羅維亞酵母尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株URA3-po1g。
　　(2)采用Gibson Assembly方法，對解脂耶羅維亞酵母內(nèi)源基因SCD(stearoyl-CoA desaturase)和DGA1(diacylgycerol acyltransferase1)，外源基因AtFAE1（fatty acid elongase1from Arabidopsis th

3、aliana）、BtFAE1(fatty acid elongase1from Brassica tournefortii、MaKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Microalgae)、MoKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Malania oleifera)和CgKCS(β-ketoacyl-CoA synthase from Cardamine graea)進行了表達質(zhì)粒

4、構(gòu)建，獲得了以下重組表達質(zhì)粒:pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_LEU、pMT-MaKCS_URA、pMT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA。
　　(3)采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將重組表達質(zhì)粒pMT-DGA1-SCD_HGR、pMT-BtFAE1-AtFAE1_EU成功導(dǎo)入URA3-po1g酵母，獲得了重組菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE

5、1)，在此基礎(chǔ)上，分別導(dǎo)入重組表達質(zhì)粒pMT-MaKCS_URA、pMT-MoKCS_URA和pMT-CgKCS_URA，成功獲得了重組菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MaKCS)、URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-MoKCS)和URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-C

6、gKCS)。
　　(4)通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分別采用氯仿-甲醇法和硫酸-甲醇法提取油脂和脂肪酸甲脂化，將得到的脂肪酸甲酯通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測，篩選到產(chǎn)神經(jīng)酸的解脂耶羅維亞酵母工程菌株URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)，其中URA3-Po1g(pMT-DGA1-SCD/pMT-BtFAE1-AtFAE1/pMT-CgKCS)7號單克隆神經(jīng)酸含量最