牛關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的制備及其對骨形成的影響.pdf

1、膠原是構(gòu)成哺乳動物細胞外基質(zhì)的主要蛋白質(zhì)。目前脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)28種膠原，其中II型膠原主要分布于關(guān)節(jié)軟骨中，對類風濕性關(guān)節(jié)炎、軟骨發(fā)育不良等疾病具有顯著療效。傳統(tǒng)的II型膠原鑒定方法如溴化氫降解法、Elisa法等方法無法同時進行類型識別和定量檢測，且存在精確度低等問題。本文采用酶法制備了牛關(guān)節(jié)軟骨中的II型膠原，并以II型膠原的特征多肽為基礎(chǔ)，建立了一種II型膠原質(zhì)譜定性定量檢測方法；同時將膠原覆層材料用于小鼠前成骨細胞培養(yǎng)，在基于質(zhì)

2、譜的蛋白質(zhì)組學研究基礎(chǔ)上，考察了不同類型膠原對細胞不同功能性蛋白表達的影響，在此基礎(chǔ)上研究II型膠原對細胞分化方向及骨形成的影響，在未來的功能食品、藥品及生物材料等領(lǐng)域具有廣泛的應用前景。主要結(jié)論如下：
　　1.采用酶法提取了牛關(guān)節(jié)軟骨中的II型膠原，并對制備的II型膠原進行鑒定。采用氯化鈉除雜和鹽酸胍抽提蛋白多糖后，在酸性條件下采用胃蛋白酶降解非膠原類蛋白，經(jīng)鹽析和透析處理去除多肽，冷凍干燥后獲得II型膠原。SDS-PAGE結(jié)果

3、表明牛II型膠原單條鏈分子量約為130 kDa；膠原酶解產(chǎn)物中檢測出牛II型膠原的特征多肽，質(zhì)譜分析結(jié)果表明II型膠原的純度為92.2％，與氨基酸組成分析結(jié)果一致，II型膠原得率為9.2%；TEM可觀測到II型膠原特有的超分子結(jié)構(gòu)；DSC結(jié)果表明制備的II型膠原在pH7.0條件下變性溫度Tm為43.68℃，且在酸性條件下較不穩(wěn)定。結(jié)果表明實驗所用方法可得到純度較高的II型膠原，鑒定結(jié)果符合II型膠原特性。
　　2.采用化學偶聯(lián)法將

4、I型膠原和II型膠原覆層在硅片上，并采用質(zhì)譜法對硅片表面覆層的膠原進行定量。以氨基硅烷和戊二醛為偶聯(lián)劑，將經(jīng)Piranha溶液處理的硅片進行膠原覆層，XPS分析結(jié)果表明經(jīng)氨基硅烷處理的硅片表面氮含量有所增加，氨基硅烷成功偶聯(lián)在硅片表面；采用HPLC-MS法對硅片表面覆層的膠原進行定量，得到Φ10 cm硅片表面I型膠原覆層量為0.81 mg，II型膠原覆層量為0.67 mg。
　　3.采用膠原覆層硅片培養(yǎng)小鼠前成骨細胞，并通過細胞培

5、養(yǎng)效果評價其生物相容性。與空白硅片相比，經(jīng)膠原覆層后的硅片細胞貼附狀態(tài)顯著改善，細胞增殖速率和細胞活性均顯著提高，結(jié)果表明膠原覆層可增強硅片的生物相容性。
　　4.對細胞蛋白進行差異性分析，并比較膠原類型對細胞分化的影響。將硅片表面培養(yǎng)的細胞裂解后提取細胞蛋白，經(jīng)HPLC-MS分析后進行蛋白質(zhì)組學研究，結(jié)果表明經(jīng)I型膠原覆層的硅片培養(yǎng)的細胞多表達與細胞增殖期和基質(zhì)合成有關(guān)的基礎(chǔ)蛋白，而經(jīng)II型膠原覆層的硅片培養(yǎng)的細胞多表達與鈣鹽沉