納米炭淋巴結(jié)示蹤在直腸癌中的運(yùn)用及新型藥物納米載體的制備與作用研究.pdf

1、直腸癌是目前人類(lèi)最高發(fā)的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療一直是最有效的治療手段。根據(jù)目前的TNM腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后準(zhǔn)確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)于患者病理分期及后期治療和隨訪計(jì)劃指定有著重要的重要指導(dǎo)意義。為了得到準(zhǔn)確的區(qū)域淋巴結(jié)評(píng)價(jià)，目前美國(guó)的NCCN指南要求在結(jié)直腸癌術(shù)后標(biāo)本中必須獲取12-14枚淋巴結(jié)。還有一些研究認(rèn)為從手術(shù)標(biāo)本中獲取更多的淋巴結(jié)對(duì)于術(shù)后準(zhǔn)確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估更有利。
　　新輔助放化療后進(jìn)行根治性直腸前切除是目前N

2、CCN指南推薦的局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。大量的研究表明這種方案可以增加術(shù)中腫瘤切除率及保留肛門(mén)括約肌的比例，也可以降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率。然而目前大量的研究證明新輔助放化療后直腸癌手術(shù)標(biāo)本中獲取的淋巴結(jié)術(shù)后會(huì)顯著減少。雖然針對(duì)新輔助放化療后這一類(lèi)患者來(lái)說(shuō)，從標(biāo)本中獲取淋巴結(jié)數(shù)目減少對(duì)于患者預(yù)后評(píng)價(jià)的影響還有爭(zhēng)議，但也有一些觀察性研究表明，在這一類(lèi)患者中，區(qū)域淋巴結(jié)陽(yáng)性患者的標(biāo)本淋巴結(jié)獲取數(shù)量明顯多于區(qū)域淋巴結(jié)陰性患者。這就預(yù)示著提高

3、這一類(lèi)患者術(shù)后標(biāo)本中淋巴結(jié)檢出數(shù)目，有可能可以提高癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的發(fā)現(xiàn)率，從而獲得更加準(zhǔn)確的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，以指導(dǎo)術(shù)后治療及隨訪計(jì)劃的制定，為患者帶來(lái)更大的獲益。
　　在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤周?chē)衬は伦⑸浼{米炭混選注射液可以提高胃腸癌手術(shù)標(biāo)本中淋巴結(jié)獲取數(shù)目，而不增加手術(shù)時(shí)間和標(biāo)本處理時(shí)間。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)新輔助放化療后直腸癌患者術(shù)后標(biāo)本中淋巴結(jié)獲取數(shù)目和陽(yáng)性癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)率之間的關(guān)系，并且評(píng)價(jià)納米炭混懸注射液在提高該類(lèi)患

4、者淋巴結(jié)檢出數(shù)目中的作用，我們從2013年8月開(kāi)始對(duì)新輔助放化療直腸癌患者運(yùn)用了這項(xiàng)技術(shù)。
　　雖然納米炭等淋巴結(jié)示蹤劑可以特異性識(shí)別淋巴結(jié)，顯著術(shù)者術(shù)中、術(shù)后標(biāo)本淋巴結(jié)的識(shí)別能力。但目前臨床上使用所有淋巴結(jié)示蹤劑均不具備腫瘤特異性，無(wú)法再術(shù)中實(shí)時(shí)辨別轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。這使得淋巴結(jié)示蹤劑的使用受到了很大的限制。
　　因此，我們計(jì)劃合成新型的納米材料，預(yù)期使其既要有特異性的淋巴結(jié)示蹤功能，也要可以卸載可特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的熒光材料，

5、以達(dá)到術(shù)中實(shí)時(shí)辨認(rèn)癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的作用。為達(dá)到此目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了結(jié)合氧化鐵納米簇和葡聚糖的新型可攜載納米淋巴結(jié)示蹤材料(DIONs)。該納米材料的大小限制在100-200nm之間，這使得它可以像納米炭一樣通過(guò)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙進(jìn)入淋巴管而特異性進(jìn)入淋巴結(jié)中，使淋巴結(jié)顯現(xiàn)出鐵離子的黑褐色。并且因?yàn)樵诩{米簇上修飾合成了葡聚糖，而使納米簇具有大量的羥基結(jié)構(gòu)。這些羥基結(jié)構(gòu)可以通過(guò)共軛效應(yīng)鏈接可以識(shí)別腫瘤細(xì)胞的熒光藥物。在特異性進(jìn)入淋巴結(jié)后，

6、在癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的酸性環(huán)境下大量釋放藥物，產(chǎn)生遠(yuǎn)大于正常的自體熒光，以達(dá)到鑒別癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的作用。本研究就在于研究合成的DIONs的方法及其淋巴結(jié)示蹤效果和生物安全性，為后期鏈接腫瘤特異性熒光藥物做基礎(chǔ)。
　　第一部分 術(shù)前粘膜下注射納米炭對(duì)于提高新輔助直腸癌患者淋巴結(jié)病理分期的作用研究
　　目的：分析新輔助放化療后直腸癌患者淋巴結(jié)檢出數(shù)目和淋巴結(jié)病理分期之間的關(guān)系。并評(píng)價(jià)納米炭混選注射液在提高新輔助放化療后直腸癌患者淋巴結(jié)檢

7、出數(shù)目及準(zhǔn)確淋巴結(jié)病理分期的作用。
　　方法：從2008年9月到2014年7月，152名連續(xù)的局部進(jìn)展期直腸癌患者接受新輔助放化療后根治性切除手術(shù)，其中45例患者術(shù)前經(jīng)肛行納米炭混懸液腫瘤周?chē)衬は伦⑸洹７治鏊谢颊咝g(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目和癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)率之間的關(guān)系，并分析注射納米炭患者和未注射納米炭患者之間淋巴結(jié)檢出數(shù)目和淋巴結(jié)病理分期之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：在淋巴結(jié)檢出1-5枚的患者中，術(shù)后淋巴結(jié)陽(yáng)性比例8.6％，明顯低于

8、淋巴結(jié)檢出數(shù)目17-44枚的37.8％。多因素分析顯示淋巴結(jié)檢出數(shù)目是淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(p=0.036)。納米炭組患者術(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目明顯高于對(duì)照組患者(21.1 vs8.0，p=0.000)。對(duì)照組術(shù)后淋巴結(jié)陽(yáng)性患者比率明顯少于納米炭組(19.6％ vs35.6％，p=0.037)。在納米炭組中發(fā)現(xiàn)的58枚癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，45枚(77.6％)被黑染。在37枚小于5mm的癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中33枚(89.2％)被黑染。

9、>　　結(jié)論：使用納米炭等淋巴結(jié)示蹤劑可以提高新輔助放化療后直腸癌患者術(shù)后淋巴結(jié)檢出數(shù)目，并且得到更加準(zhǔn)確的淋巴結(jié)病理分期。
　　第二部分 葡聚糖修飾納米氧化鐵分散液的制備及淋巴結(jié)示蹤的作用和生物安全性研究
　　目的：本研究的目的在于制備和表征可攜載藥物的葡聚糖修飾納米氧化鐵分散液(DIONs)，評(píng)價(jià)其淋巴結(jié)示蹤功能及生物安全性。
　　方法：我們利用三價(jià)鐵、二價(jià)鐵與右旋糖干經(jīng)化學(xué)共沉淀得到DIONs并表征其理化性質(zhì)。將合

10、成的DIONs于大鼠胃壁漿膜下注射，觀察DIONs的區(qū)域淋巴結(jié)示蹤功能。并通過(guò)DIONs與人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)及CCK-8法評(píng)價(jià)其體外細(xì)胞生物安全性。通過(guò)觀察大鼠注射后三個(gè)月內(nèi)不同時(shí)期肝腎功能及腹腔情況，了解DIONs的體內(nèi)生物安全性。通過(guò)DIONs攜載Cy5熒光以及對(duì)示蹤大鼠的解剖，了解DIONs在心、腦、肝、肺、腎等重要器官的代謝情況。
　　結(jié)果：我們合成的DIONs流體動(dòng)力學(xué)直徑為165nm，可將氧化鐵納米簇離子包裹起來(lái)，形成穩(wěn)

11、定納米結(jié)構(gòu);有很好的水溶性、磁性和穩(wěn)定性，而且本身為深棕色。其合適的大小、穩(wěn)定性及黑褐色使得經(jīng)過(guò)胃壁漿膜下注射后淋巴結(jié)特異性好，6小時(shí)后區(qū)域淋巴結(jié)開(kāi)始染色，24小時(shí)染色時(shí)間最佳，48小時(shí)后逐漸褪色但仍可清晰辨認(rèn)，得到良好的區(qū)域淋巴結(jié)示蹤效果。通過(guò)DIONs與人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)及CCK-8法檢測(cè)，可見(jiàn)其有良好的體外細(xì)胞生物安全性。通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間（漿膜下注射4天至3個(gè)月）對(duì)大鼠血液學(xué)及組織病理學(xué)觀察，DIONs具有良好的生物安全性及相容性。通過(guò)D