柑橘顯微結(jié)構(gòu)和miRNA對硼毒害的響應(yīng).pdf

1、硼毒害是近年我國南方柑橘產(chǎn)區(qū)由于B肥施用不當(dāng)引起的生理性病害，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)馗涕俚脑耘嗌a(chǎn)。本研究利用沙培法，以不同B水平處理（對照：10μM H3BO3；B毒害：400μM H3BO3）的雪柑（Citrus sinensis）和酸柚（C. grandis）實生苗為試驗材料，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究手段研究 B毒害處理對柑橘根葉顯微結(jié)構(gòu)以及體內(nèi)B分布，葉片miRNA表達(dá)和根尖miRNA表達(dá)等的影響，并在此基礎(chǔ)上對B毒害響應(yīng)miR39

2、7a如何影響葉片維管組織B轉(zhuǎn)運(yùn)的生物學(xué)機(jī)制展開系統(tǒng)研究和探討。旨在闡述柑橘B毒害的發(fā)生機(jī)理和柑橘miRNA響應(yīng)B毒害的分子調(diào)控機(jī)制，為B肥的合理使用和柑橘高優(yōu)栽培提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用沙培法進(jìn)行柑橘長期B毒害處理，發(fā)現(xiàn)B毒害癥狀只發(fā)生在酸柚葉片中；B毒害顯著影響酸柚植株地上部和地下部生物量、葉片光合生理指標(biāo)以及葉綠素?zé)晒?，但對雪柑沒有顯著影響；表明雪柑比酸柚更耐受B毒害。B毒害主要作用于柑橘葉片維管組織，引

3、起不耐B毒酸柚韌皮組織細(xì)胞程序性死亡（PCD）。B毒害處理顯著增加柑橘葉片總B含量，但耐B毒雪柑葉片總B含量與不耐B毒酸柚片總B含量沒有顯著差異；半定量qPCR顯示B毒害柑橘葉片中的BOR1幾乎不表達(dá)，NIP5;1的表達(dá)量沒有顯著變化，而BOR4在B毒害雪柑和酸柚中的表達(dá)量均略有上升，但兩者之間沒有顯著差異；表明柑橘可能具有不依賴于“外排轉(zhuǎn)運(yùn)”的耐B毒機(jī)制。⑵通過高通量測序，本研究從B處理酸柚和雪柑葉片中共發(fā)現(xiàn)699個候選miRNA（3

4、87個保守miRNA，312新miRNA）。B毒害分別引起酸柚和雪柑葉片中51個（25個上調(diào)，26個下調(diào)）和20個（16個上調(diào)，4個下調(diào)）miRNA發(fā)生差異表達(dá)。Stem-loop qRT-PCR顯示， miRNA395a和 miR397a是酸柚葉片中上調(diào)表達(dá)最為顯著的2個miRNA，但它們在雪柑中均發(fā)生下調(diào)表達(dá)。通過RLM-5’-RACE，本研究確認(rèn)了miR397a靶向剪切LAC4和LAC17。進(jìn)一步的細(xì)胞化學(xué)研究顯示，miR397a

5、在酸柚葉片中上調(diào)表達(dá)降低了LAC4和LAC17的表達(dá)水平并抑制了木質(zhì)部細(xì)胞壁的次生發(fā)育，而在雪柑葉片中的抑制表達(dá)引起LAC4上調(diào)并引起木質(zhì)部細(xì)胞壁在紋孔附近產(chǎn)生次生沉積。結(jié)合前期研究結(jié)果，本研究表明，miR397a通過靶向調(diào)控LAC4和LAC17參與木質(zhì)部細(xì)胞壁次生代謝，可能降低B由木質(zhì)部向韌皮部的轉(zhuǎn)運(yùn)從而緩解B對韌皮部的毒害。⑶基于mRNA原位雜交、細(xì)胞化學(xué)定位和原位檢測分析技術(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)miR397a及其靶基因在木質(zhì)部特異性表達(dá)；

6、B毒害導(dǎo)致雪柑LAC4在后生木質(zhì)部上調(diào)表達(dá)；引起木質(zhì)素經(jīng)高爾基器介導(dǎo)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)在后生木質(zhì)部細(xì)胞壁大量積累；有效地限制了B由木質(zhì)部向韌皮轉(zhuǎn)運(yùn)并降低了韌皮部的B水平。結(jié)合前期研究結(jié)果，本文提出了柑橘耐B毒害的一個新模型：耐B毒柑橘通過抑制木質(zhì)部miR397a表達(dá)，靶向上調(diào)LAC4促進(jìn)木質(zhì)部中木質(zhì)素的次生合成，將蒸騰流中的B截留在木質(zhì)部中，減少自由態(tài)B在韌皮組織中積累并降低韌皮組織的B水平從而緩解B過量對韌皮部產(chǎn)生毒害作用。⑷應(yīng)用HiSeq2

7、500高通量測序，本研究從B毒處理酸柚和雪柑根尖中共分離鑒定了172個miRNA（5個為柑橘已知miRNA，167個為新的候選miRNA），其中37個miRNA的表達(dá)量在酸柚根尖中顯著改變，但僅有11個在雪柑根尖中發(fā)生明顯變化。結(jié)合qRT-PCR檢測和RLM-5’-RACE驗證，最終確定 Ciclev10000756m.g.v1.0， Ciclev10018916m.g.v1.0和 Ciclev10003452m.g.v1.0分別被 m

8、iR319、miR171家族多個成員和miR396g-5p介導(dǎo)剪切。生物信息學(xué)分析表明Ciclev10000756m.g.v1.0編碼的MYB類似蛋白與AtMYB61具有同源性，而AtMYB61參與擬南芥的側(cè)根形成。結(jié)合解剖學(xué)研究結(jié)果，不耐B毒酸柚可能存在如下長期B毒害的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制：B毒害對植株地上部造成的傷害通過營養(yǎng)脅迫的方式向根系傳遞信號，根尖接收信息并上調(diào) miR319的表達(dá)，靶向下調(diào) MYB并抑制側(cè)根的形成，有限度地降低根系