Hs-MB型電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)分子信標(biāo)的研制及其應(yīng)用研究.pdf

1、伴隨著基因結(jié)構(gòu)和基因功能研究的深入開(kāi)展，尤其是“人類(lèi)基因組項(xiàng)目”完成后，對(duì)于人類(lèi)相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療的研究邁入了一個(gè)新的紀(jì)元，但其首要條件在于對(duì)致病基因堿基序列的識(shí)別和確定。而傳統(tǒng)的DNA測(cè)序方法存在一些局限，比如，勞動(dòng)強(qiáng)度大且消耗時(shí)間較長(zhǎng)。但是隨著Watson-Crick對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的深入探究，為分子生物學(xué)的相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)全新的基因檢測(cè)方法-DNA探針。其中，以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA探針技術(shù)，當(dāng)結(jié)合一些標(biāo)記方法

2、，比如，熒光法，電化學(xué)法，化學(xué)發(fā)光法后，將會(huì)使DNA探針得到一定程度的優(yōu)化使用，比如，免去了放射性物質(zhì)對(duì)人體的危害；降低了標(biāo)記物昂貴的價(jià)格；節(jié)省了操作時(shí)間等，具有特異性好，快速靈敏，操作簡(jiǎn)便和無(wú)污染等特點(diǎn)，且還具有分離純化基因及分子識(shí)別的功能。目前這種類(lèi)型的分子探針已經(jīng)成為基因研究領(lǐng)域中最具有吸引力的課題之一。
　　 最關(guān)鍵的問(wèn)題在于怎樣找出導(dǎo)致各種各樣基因疾病的基因，并且具有高靈敏度和高選擇性。目前檢測(cè)DNA的錯(cuò)配差異性最有用

3、的工具是分子信標(biāo)，其和線(xiàn)形信標(biāo)相比，具有高的目標(biāo)選擇性，因?yàn)樾艠?biāo)分子特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)使得在檢測(cè)前多了一步打開(kāi)莖環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)而才與目標(biāo)物進(jìn)行雜交反應(yīng)的過(guò)程。因此在某種程度上提高了選擇性。在本論文中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型的電化學(xué)分子信標(biāo)，將之命名為“新型電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)分子信標(biāo)”，其作用機(jī)理類(lèi)似于傳統(tǒng)的以熒光基團(tuán)一猝滅基團(tuán)為基礎(chǔ)的分子信標(biāo)。在此，我們使用了具有二聚能力的卟啉鐵分子，并將其連接在分子信標(biāo)兩端，在沒(méi)有目標(biāo)分子存在時(shí)，連接在信標(biāo)兩端的完全相

4、同的卟啉鐵分子因?yàn)槭艿角o環(huán)的作用力而無(wú)限靠近，因此呈現(xiàn)二聚狀態(tài)，此時(shí)表現(xiàn)出非電化學(xué)活性特征，電化學(xué)信號(hào)被抑制；當(dāng)加入目標(biāo)分子時(shí)，分子信標(biāo)將于目標(biāo)序列互補(bǔ)結(jié)合，此時(shí)分子燈塔被迫使打開(kāi)，連接在其上的兩個(gè)卟啉鐵分子也同時(shí)被強(qiáng)制分開(kāi)，破壞了卟啉鐵的二聚體結(jié)構(gòu)而使卟啉鐵以單體狀態(tài)存在，因此此時(shí)電信號(hào)恢復(fù)。這種類(lèi)型的信標(biāo)既具有傳統(tǒng)熒光信標(biāo)簡(jiǎn)單快捷、易于控制的特點(diǎn)，又具有電化學(xué)技術(shù)成本低廉、易于小型化、便于野外操作的優(yōu)勢(shì)。本研究分為三個(gè)部分：

5、　　 第一章：緒論。以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA探針技術(shù)，結(jié)合一些標(biāo)記方法后，比如，熒光方法，電化學(xué)方法，化學(xué)發(fā)光方法后，使DNA探針得到一定程度的優(yōu)化，為分子生物學(xué)的相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)全新的基因檢測(cè)方法.分子信標(biāo)技術(shù)以其高選擇性及特異性成為目前基因研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。本章通過(guò)對(duì)分子信標(biāo)技術(shù)，主要從熒光分子信標(biāo)和電化學(xué)分子信標(biāo)及卟啉鐵的性質(zhì)及應(yīng)用的歸納及總結(jié)，詳細(xì)說(shuō)明了本論文所研究課題的理論基礎(chǔ)和選題依據(jù)。最后闡述了本論文的目的意

6、義及創(chuàng)新之處。
　　 第二章：Hemin電化學(xué)開(kāi)關(guān)行為的探討和Hs-MB電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)分子信標(biāo)的合成研究。眾所周知，hemin是一種高度疏水性的分子，在中性和弱堿性溶液中具有較差的溶解性，大量的科研數(shù)據(jù)已經(jīng)證明：hemin溶液的物理和化學(xué)性質(zhì)隨著它的聚集狀態(tài)的改變而改變，因?yàn)閔emin的結(jié)構(gòu)中存在疏水性基團(tuán)乙烯基，致使hemin的卟啉結(jié)構(gòu)部分聚集趨勢(shì)相當(dāng)明顯。本章通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明hemin的單體和二聚體的電信號(hào)值存在很大的差異，可以

7、將其用在新型電化學(xué)活性分子開(kāi)關(guān)上。同時(shí)，通過(guò)采用各種方法對(duì)所合成的新型電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)分子信標(biāo)進(jìn)行表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合成出的分子信標(biāo)良好，為新型信標(biāo)在生物化學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三章：基于Hs-MB型電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)分子信標(biāo)的應(yīng)用研究。p53基因是一種重要的致癌基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人類(lèi)50％的腫瘤是因?yàn)榇嬖趐53基因的突變或缺失，因此p53基因的檢測(cè)就顯得至關(guān)重要。在本章中，我們首先合成了一種Hs-MB型電化學(xué)活性開(kāi)關(guān)

8、分子信標(biāo)，這種類(lèi)型的信標(biāo)分子在未加目標(biāo)分子的情況下沒(méi)有電化學(xué)信號(hào)，但當(dāng)與完全互補(bǔ)雜交序列發(fā)生雜交反應(yīng)后則產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，并將其應(yīng)用于p53基因的定性、定量檢測(cè)及其SNP突變的識(shí)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，電化學(xué)檢測(cè)DPV的峰電流值與目標(biāo)DNA的濃度之間有良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為y=8E-08x+2E-07(x為目標(biāo)序列的濃度，y為響應(yīng)的峰電流值，R=0.9861)，得到其最低檢測(cè)限為3nmol。且對(duì)一堿基錯(cuò)配序列與完全互補(bǔ)序列的響應(yīng)信號(hào)有較明顯