新型電化學酶傳感器的研制及其應用研究.pdf

1、目前，用于固定化酶及其它生物活性物質(zhì)的載體種類繁多，包括各種無機和有機物質(zhì)以及各種天然和合成的高分子聚合物。但是要保持固定化酶在電極上的高活性、高穩(wěn)定性，還沒有一種載體能夠達到盡善盡美。殼聚糖是甲殼素在堿性條件下脫乙?；磻玫降难苌?，具有機械性能良好，生物相容性好，易成膜以及無毒和良好的生理惰性等優(yōu)點，特別是分子中存在的大量氨基和羥基，使其既易與蛋白質(zhì)和酶共價結合，又可絡合金屬離子，使酶免受金屬離子的抑制。此外，殼聚糖價格低廉且易降

2、解，對人體和環(huán)境無害。自1994年第一次被報道用于修飾電極以來[5]，在過去的十年中，殼聚糖作為一種膜材料在修飾電極及生物傳感器的制備方面得到廣泛的應用。 本論文研究了以殼聚糖或殼聚糖復合膜為載體在玻碳電極上固定辣根過氧化物酶、氯化血紅素、葡萄糖氧化酶制備過氧化氫和葡萄糖生物傳感器，討論了傳感器制備過程中的各種影響因素，優(yōu)化了實驗條件，豐富了電流型酶傳感器的內(nèi)容。 主要工作如下：1.以殼聚糖為載體固定辣根過氧化物酶制備電

3、流型過氧化氫生物傳感器在玻碳電極(GCE)上固定辣根過氧化物酶(HRP)制備過氧化氫生物傳感器，系統(tǒng)地研究了傳感器制備過程中的各種影響因素，以及過氧化氫在該傳感器上的安培響應。殼聚糖膜的包埋及乙二醛的交聯(lián)作用可以將HRP牢固的固定在GCE上，殼聚糖載體可較大限度地保持固定化酶的生物活性。實驗研究了HRP電極的選擇性和穩(wěn)定性以及對于H2O2的檢測靈敏度和檢測范圍。在0.02mol/L的pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，工作電位為-100mV(

4、vs.SCE)時，HRP電極具有最佳的電化學響應。HRP電極的還原峰電流隨過氧化氫的連續(xù)加入而不斷增大，在3.5×10-5-1.1×10-3mol/L范圍內(nèi)成良好的線性關系，線性回歸方程為：I/μA=0.29+1.2c(H2O2濃度c的單位為mol/L)，相關系數(shù)為r=0.9994，檢測限為8.0×10-6mol/L(S/N=3)，計算出米氏常數(shù)Kmapp為2.0×10-3mol/L。該HRP酶電極對于H2O2的檢測靈敏度為12.18μ

5、A/mM。H2O2濃度為2.0×10-4mol/L時，連續(xù)測定6次，其變異系數(shù)(RSD)為2.0％。葡萄糖、果糖、蔗糖、檸檬酸、半胱胺酸、硝酸鉀、草酸、氟化銨8種物質(zhì)對于酶電極的響應信號沒有干擾，只有抗壞血酸對酶電極響應信號產(chǎn)生明顯影響。 2.辣根過氧化物酶在殼聚糖/聚乙烯吡咯烷酮復合膜內(nèi)的固定及其用于過氧化氫安培傳感器。以殼 聚糖/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)復合膜為載體固定辣根過氧化物酶制備了過氧化氫傳感器。研究了殼聚糖

6、與PVP復合膜的組成比對于傳感器響應信號的影響，當1.0％的殼聚糖溶液與2.5％的PVP溶液體積比為9：1時，制得的傳感器具有最好的響應信號和穩(wěn)定性，此復合膜適合辣根過氧化物酶的固定。研究了酶電極制備過程中的一些影響因素以及酶電極對于H2O2的電流響應。在0.02mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，工作電位為0mV(vs.SCE)時，HRP電極對H2O2的電化學響應在5s內(nèi)即可達到最大值，檢測范圍為6.0×10-6至1.7×10-4

7、mol/L，線性回歸方程為：I/μA=0.89+0.06c(H2O2濃度c的單位為mol/L)，相關系數(shù)為r=0.9992，檢測靈敏度為62.5μA/mM，檢測限為2.5×10-6mol/L，計算其米氏常數(shù)Kmapp為1.7×10-4mol/L。在H2O2濃度為1.0×10-4mol/L時，連續(xù)6次測定HRP電極的響應電流，其變異系數(shù)(RSD)為1.8％。最后研究了酶電極的選擇性及穩(wěn)定性。 3.葡萄糖氧化酶在殼聚糖/聚乙烯吡咯烷

8、酮復合膜內(nèi)的固定及其用于葡萄糖傳感器以殼聚糖/聚乙烯吡咯烷酮復合膜為載體固定葡萄糖氧化酶(GOD)，制備葡萄糖傳感器，考查了傳感器制備過程中的各種影響因素。在0.02mol/LpH6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，工作電位300mV(vs.SCE)時，GOD電極對于溶液中葡萄糖的催化氧化電流與溶液中葡萄糖濃度在5.0×10-5-8.5×10-4mol/L范圍內(nèi)成良好的線性關系，線性回歸方程為：Ip/μA=-5.965×103c-1.203(葡萄

9、糖濃度c的單位mol/L)，相關系數(shù)為r=0.9933，檢測限為2.0×10-5mol/L(S/N=3)，計算得米氏常數(shù)Kmapp為2.86×10-3mol/L。該GOD電極對于葡萄糖的檢測靈敏度為5.72μA/mM。在葡萄糖濃度為5.2×10-4mol/L時，連續(xù)6次測定GOD電極的響應電流，變異系數(shù)(RSD)為2.5％。此GOD電極具有較好的穩(wěn)定性，保存于4℃的緩沖溶液中，一個月內(nèi)可保持70％的活性；如果GOD電極放于4℃空氣中保存

10、，兩個月內(nèi)GOD電極可保持85％的活性。同時研究了此GOD電極的選擇性及對于實際樣品的測定，結果滿意。 4.氯化血紅素在殼聚糖/Nafion復合膜內(nèi)的固定及其用于電流型過氧化氫傳感器以殼聚糖/Nafion復合膜為載體在玻碳電極上固定氯化血紅素制備過氧化氫傳感器。實驗結果顯示，1.0％的殼聚糖乙酸溶液與1.0％的Nafion乙醇溶液的體積比為6：4時，所得復合膜最適于血紅素的固定。研究了傳感器制備過程中的影響因素及血紅素電極的電化

11、學性質(zhì)，在1.0mol/LpH9.8的NH3-NH4Cl緩沖溶液中，工作電位為-450mV(vs.SCE)時，血紅素電極對H2O2的催化還原峰電流與H2O2濃度在4.0×10-5-1.5×10-3mol/L范圍內(nèi)成良好的線性關系，線性回歸方程為：Ip/μA=3.34+3.6c(H2O2濃度c的單位為mol/L)，相關系數(shù)為r=0.9960，檢測靈敏度為35.4μA/mM，檢測限為3.5×10-5mol/L(S/N=3)，計算得米氏常數(shù)K