大葉麻竹筍多糖的分離純化和鑒定.pdf

1、竹筍(Bamboo shoot)是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)植物的新生芽，一直以來以高纖維、低脂、營養(yǎng)豐富的“素食第一品”著稱;大葉麻竹（Dendrocalamus1atif1orus）是中國產筍量最高的品種之一，具有較高的營養(yǎng)價值。竹筍多糖是從竹類資源中提取到的一類活性多糖，它具有多種生物活性，比如抗氧化、抗腫瘤、降血糖等等。目前國內外關于竹筍多糖的研究報道較少，本文擬通過對大葉麻竹筍多糖的提取、分離純

2、化工藝及其結構的探究，從而為大葉麻竹筍資源的綜合開發(fā)利用奠定初步的實驗基礎。
　　本文以重慶產大葉麻竹筍為原料，分別對竹筍粗多糖的提取工藝、分離純化工藝進行探究，對純化后的多糖結構進行鑒定。提取工藝方面，擬選擇正交實驗優(yōu)化水提醇沉法、響應面優(yōu)化超聲波輔助提取法和單因素優(yōu)化酶法輔助法提取大葉麻竹筍粗多糖。分離純化工藝方面，選擇不同脫蛋白方法進行比較，得出較優(yōu)的脫蛋白方法，再經過流水透析后進行DEAE-Ce11ufose52柱色譜和S

3、ephadexG-50葡聚糖凝膠柱色譜分級純化，最后進行純度鑒定。結構鑒定方面，先進行多糖理化性質分析，然后采用凝膠過濾法(GPC)測定其分子量大小，β-消除反應法結合氨基酸組分分析進行糖肽鍵聯(lián)接方式分析，剛果紅實驗分析是否具有三股螺旋結構，氣相色譜法分析單糖組成，紅外光譜和核磁共振分析多糖構型等等。本文的主要研究結果如下:
　　1、大葉麻竹筍多糖提取工藝的的研究
　　(1)以烘干粉碎后的大葉麻竹筍粉為原料，采用水提醇沉法提

4、取粗多糖，進行正交實驗優(yōu)化，由極差分析和方差分析可知，各因素影響的主次順序為:乙醇終濃度＞料液比＞提取時間＞提取溫度，最優(yōu)提取工藝條件為:料液比為1∶40，醇終濃度為80％，提取溫度為80℃，提取時間為1h，提取2次，大葉麻竹筍粗多糖的提取率為2.09％。
　　(2)通過響應面優(yōu)化超聲輔助提取大葉麻竹筍粗多糖，得出最優(yōu)超聲輔助提取工藝條件為:超聲時間29min，超聲功率400W，超聲溫度55℃，超聲提取2次，80％乙醇終濃度沉淀，

5、大葉麻竹筍粗多糖提取率2.49％。
　　(3)通過考察中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶酶解輔助提取大葉麻竹筍粗多糖，可知中性蛋白酶對大葉麻竹筍粗多糖提取率影響最大;通過單因素變化法獲得了較佳的中性蛋白酶輔助提取條件:提取溫度45℃，pH值4.6，酶解60min，酶解2次，在80℃條件下水提60min，80％乙醇終濃度沉淀，提取率為2.89％。
　　(4)通過比較以上3種大葉麻竹筍多糖提取工藝可知，水提醇沉法提取率最低，酶法輔助法

6、提取率最高，但是提取周期較長，成本較高;超聲波輔助提取時間較短，但提取率低于酶法輔助提取;從提取效率的角度考慮，宜選擇超聲波輔助提取工藝提取大葉麻竹筍多糖。
　　2、大葉麻竹筍多糖純化工藝的的研究
　　(1)通過比較不同的脫蛋白工藝，木瓜蛋白酶結合Sevag法，多糖保留率為63.2％，蛋白去除率達到81.3％，多糖保留率和蛋白質去除率較高，是較優(yōu)的脫蛋白工藝。由于大葉麻竹筍粗多糖溶液顏色為淺黃色，可以通過流水透析除去大部分色

7、素。
　　(2) DEAE纖維素陰離子交換柱初次純化，以純水、0.05mol/LNaCl、0.1mo1/LNaCl、0.2mo1/LNaCl、0.5mo1/L NaCl（5個梯度）為洗脫液進行洗脫，得到5個洗脫峰。分別對吸收峰洗脫液進行濃縮冷凍干燥后，得到5個大葉麻竹筍多糖組分BSP1、BSP2、BSP3、BSP4、BSP5，其得率分別為19.3％、25.4％、29.6％、4.6％、2.2％。由于BSP4、BSP5得率太低，而BS

8、P1、BSP2、BSP3相對得率較高，所以將BSP1、BSP2、BSP3作為主要的洗脫組分進行下一步繼續(xù)純化。
　　(3) Sephadex-50葡聚糖凝膠柱色譜再次純化，BSP1、BSP2、BSP3均依次用純水、0.05mo1/L NaCl和0.1 mo1/L NaCl洗脫液洗脫。其中BSP1通過以上三種洗脫液洗脫獲得BSP1A、BSP1B、BSP1C三種多糖組分，其得率分別為40.6％、8.5％、5.3％; BSP2通過以上三

9、種洗脫液洗脫獲得BSP2A、BSP2B、BSP2C三種多糖組分，其得率分別為47.9％、5.5％、9.8％; BSP3通過以上三種洗脫液洗脫獲得BSP3A、BSP3B、BSP3C、BSP3D四種多糖組分，其得率分別為4.7％、53.4％、3.8％、5.9％。綜合考慮，選擇BSP1A、BSP2A、BSP3B為主要多糖組分進行后面的實驗研究。
　　(4)凝膠過濾和紫外全波段掃描進行純度鑒定，測得BSP1A、BSP2A、BSP3B純度分

10、別為96.1％、95.3％、95.7％，鑒于紫外全波段掃描在260nm和280nm處均無明顯吸收峰，從而可以判斷BSP1A、BSP2A、BSP3B3種多糖組分是較純的多糖物質。
　　3、大葉麻竹筍多糖結構鑒定
　　(1)大葉麻竹筍多糖基本理化性質的結果分析如下:大葉麻竹筍多糖組分(BSP1A、BSP2A、BSP3B)在水中溶解性一般，三種多糖組分在水中的溶解性依次為BSP3B＞BSP2A＞BSP1A，不溶于常用有機溶劑;三種

11、多糖組分均不含有多酚類物質、單糖、雙糖及淀粉。大葉麻竹筍多糖組分BSP1A、BSP2A、BSP3B的總糖含量分別為95.3％、96.1％、95.7％;糖醛酸含量分別為1.8％、6.7％、7.6％;蛋白質含量分別為2.4％、1.8％、2.1％。葡聚糖凝膠法(GPC)測得BSP1A、BSP2A、BSP3B的分子量分別為10233Da、16982 Da、19952Da。
　　(2)通過β-消除反應分析糖肽鍵鏈接方式，經過堿水解后的三種多

12、糖溶液的紫外掃描圖譜，在240nm處吸光度增加，結合堿解前后氨基酸數(shù)量的變化，可知三種大葉麻竹筍多糖均存在O-糖肽鍵(-O-Ser或-O-Thr)連接方式。通過剛果紅實驗，可以推斷BSP1A、BSP2A、BSP3B均具有三股螺旋結構。
　　(3)通過單糖組分分析，大葉麻竹筍多糖組分BSP1A由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成，摩爾比為1∶40.62∶8.65;大葉麻竹筍多糖組分BSP2A和BSP3B均由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和

13、半乳糖四種單糖組成，摩爾比分別為5.43∶1∶2.87∶10.37和6.57∶1∶3.69∶12.08。
　　(4)紅外光譜分析結果表明， BSP2A和BSP3B具有β-D-吡喃型糖環(huán)，但BSP1A同時含有β-D-吡喃型和α-D-吡喃型糖環(huán)。
　　(5)綜合1H NMR和13C NMR譜圖，可以確定BSP1A是一種以β-1，6-吡喃型葡萄糖為主要鏈接方式，并且有少量吡喃半乳糖和吡喃阿拉伯糖以1，6-糖苷鍵與之相連;BSP2A