煙堿的提取工藝優(yōu)化及其殺蟲活性研究.pdf

1、煙堿有很強的內(nèi)吸活性、胃毒性和觸殺毒性，能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，對寄生蟲的乙酰膽堿受體有很強的親和性，使乙酰膽堿不能正常傳導、阻斷神經(jīng)、窒息死亡?，F(xiàn)在對煙堿殺蟲劑的開發(fā)多見于植保領域，煙堿在水產(chǎn)上雖有悠久的應用歷史，但是并無深入的研究。本文主要針對煙堿這一植物源殺蟲成分，考察了其有效的提取方式，以秀麗隱桿線蟲為模式生物探究了煙堿的體外殺蟲效果，并探究了煙堿的對小瓜蟲和指環(huán)蟲的殺滅作用及其對環(huán)境的影響。
　　1.為了篩選出最佳的

2、提取方式，比較了超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶輔助提取法和索氏回流法這幾種提取方法對于煙堿的提取效率，發(fā)現(xiàn)提取效率最高的是超臨界CO2萃取法和酶輔助提取法。再從經(jīng)濟價值的角度進行比較，酶輔助提取法較超臨界CO2萃取法更為操作簡單，成本低廉，從提取成本角度更有價值，易于在工業(yè)生產(chǎn)上推廣。
　　2.以煙堿的得率為評價指標，設計酶解時間、酶解溫度，pH及提取時間4因素3水平的實驗模型，采用Design Expe

3、rt8.0.6分析軟件優(yōu)化酶輔助法提取煙堿的條件。以單因素試驗為基礎，通過響應曲面分析來優(yōu)化廢棄煙葉的煙堿提取工藝，并得到回歸方程。試驗首先考察了酶解時間、酶解溫度酶用量、pH等4組單因素水平對煙堿的影響，進行了響應面試驗設計，結果表明，各影響因素對煙堿得率的影響程度大小依次為酶解溫度、酶解時間、酶用量、pH。優(yōu)選出最佳提取工藝結合實際為酶解時間2.00h，酶解溫度48.50℃，酶用量2.10％，pH4。根據(jù)優(yōu)化條件進行三組平行試驗，煙

4、堿提取得率平均值為3.320mg/g，與預測值相差較小。
　　3.本章選取秀麗隱桿線蟲作為煙堿體外殺蟲的模式生物，選擇運動行為、最長壽命、生殖、個體發(fā)育、乙酰膽堿酯酶、細胞凋亡活性作為評價指標，比較研究了煙堿對秀麗隱桿線蟲的毒性效應，結果表明煙堿暴露能夠引起壽命的減少，體長的降低、運動行為的缺陷、子代數(shù)目的減少、細胞調(diào)亡水平的増加還能抑制乙酰膽堿酯酶的活性。
　　在實驗濃度下，煙堿暴露對秀麗隱桿線蟲的壽命、體長、運動行為水平

5、及子代目都能產(chǎn)生顯著的負面效應，表明低濃度的煙堿暴露就能夠對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生發(fā)育毒性、神經(jīng)行為毒性及生殖毒性。在實驗濃度下，煙堿對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)脂褐素累積和ROS水平?jīng)]有產(chǎn)生顯著的影響，表明實驗濃度下煙堿的暴毒并不是通過氧化損傷途徑對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)生毒性效應；
　　當暴毒濃度達到0.25mg/ml時，秀麗隱桿線蟲的細胞調(diào)亡水平就有顯著地提高，與空白組相比，L4期幼蟲暴毒24h后秀麗隱桿線蟲在煙堿濃度為0.5mg/ml、1mg/m

6、l時即顯著降低(P＜0.05),煙堿濃度大于0.5mg/ml時就會對線蟲的細胞凋亡水平產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01)，煙堿暴毒對生理水平的影響可能與細胞調(diào)亡水平的提高有關。L1期幼蟲暴毒72h后秀麗隱桿線蟲在煙堿濃度為1mg/ml時即產(chǎn)生乙酰膽堿酯酶活性顯著降低(P＜0.05),煙堿濃度大于1.5mg/ml時就會對乙酰膽堿酯酶活性產(chǎn)生極顯著影響(P＜0.01)，說明煙堿主要是通過抑制乙酰膽堿酯酶活性擾亂神經(jīng)傳導，從而導致線蟲的行為缺陷。

7、
　　4.煙堿對指環(huán)蟲和小瓜蟲有顯著的驅殺效果，在煙堿使用后，各實驗組蟲體均有顯著減少，在作用的第二天就顯現(xiàn)出對寄生蟲的抑制作用，作用第6~7d，對寄生蟲表現(xiàn)出了良好的驅殺作用。在以柵列藻和銅綠微囊藻為非靶標藻類衡量煙堿對水環(huán)境的影響中，發(fā)現(xiàn)煙堿對藻類的生長呈抑制作用。
　　煙堿對藻類的抑制反映在對藻膽蛋白含量的影響上，能夠在一定程度上影響藻膽蛋白各組分的構成來阻遏銅綠微囊藻的PSⅡ作用位點，從而抑制藻類的生長。