酸性普魯蘭酶的高效表達(dá)及其熱穩(wěn)定性改良研究.pdf

1、普魯蘭酶能特異性水解支鏈淀粉的α-1，6-糖苷鍵，在淀粉水解工藝過程中有著很高的應(yīng)用價(jià)值。來源于Bacillus naganoensis(ATCC53909)的普魯蘭酶PulB性質(zhì)優(yōu)良，但其在60℃的熱穩(wěn)定性很差，且表達(dá)量低，仍難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。為了獲得表達(dá)水平高，熱穩(wěn)定性強(qiáng)的普魯蘭酶，本文先后對普魯蘭酶PulB進(jìn)行了翻譯速率優(yōu)化和熱穩(wěn)定性改良研究。
　　為了提高PulB表達(dá)水平，本文從極端稀有密碼子、類SD序列、mRNA二級

2、結(jié)構(gòu)三個(gè)方面對目標(biāo)基因自身進(jìn)行了優(yōu)化。通過改善序列中精氨酸的密碼子使用，獲得了普魯蘭酶表達(dá)量分別提高34.37％的PulB-573R突變體和提高16.89％的PulB-645R突變體，組合突變后的PulB-R573/R645突變體表達(dá)量較野生型提高了47.73％。此外，我們將PulB序列中的類SD序列進(jìn)行了敲除突變，獲得了表達(dá)量提高34.6％的SD2突變體。在提高普魯蘭酶PulB的熱穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)，耐熱突變體PulB-N387D中第

3、387位的天冬氨酸在使用GAC密碼子時(shí)表達(dá)量大幅下降，而用同義密碼子GAU替換后，消除了mRNA二級結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使PulB-N387D2的表達(dá)水平較PulB-N387D1提高了93％。
　　由于野生型普魯蘭酶PulB的熱穩(wěn)定性較差(65℃下t1/2僅有3.5 min)，實(shí)驗(yàn)室前期通過同源建模、序列比對，構(gòu)建了PulB一系列單點(diǎn)突變體，篩選出多個(gè)普魯蘭酶耐熱突變體。本研究在改善耐熱突變體PulB-N387D表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，組

4、合3個(gè)有益單點(diǎn)突變體(D328H、N387D、A414P)，構(gòu)建PulB-D328H/N387D和PulB-D328H/N387D/A414P突變體，其中PulB-328/387/414耐熱性最好，它在65℃下的t1/2比PulB-WT提高12.9倍，Tm值比野生型提高了4.91℃，并且酶促動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明PulB-328/387/414的kcat和kcat/Km比PulB-WT分別提高了38.8％和12.9％。熱穩(wěn)定性最好的組合突變體P