3t3細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展

1、3T3 3T3 細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展 細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法研究進(jìn)展×××綜述（廣東省疾病預(yù)防控制中心）關(guān)鍵詞：3T3，光毒性，體外替代試驗(yàn)前言：光毒性是指一次接觸化學(xué)物質(zhì)后的皮膚繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的的一種皮膚毒性反應(yīng)，亦或者全身應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應(yīng)。而近年來(lái)的臨床應(yīng)用過(guò)程中，很多不同類型的藥物均出現(xiàn)了光毒性反應(yīng)。當(dāng)中包括了臨床上常用的氟喹諾酮類抗

2、菌藥、非甾體消炎藥物、抗組胺藥物、抗抑郁藥物、抗驚厥藥物、利尿劑、抗真菌藥物和抗高血壓藥物等[1-4],引起了人們對(duì)藥物光毒性的關(guān)注。而目前對(duì)于藥物光毒性的檢測(cè)，傳統(tǒng)的光毒性檢驗(yàn)以動(dòng)物試驗(yàn)為主，光毒性動(dòng)物試驗(yàn)簡(jiǎn)單，方法成熟，但試驗(yàn)周期長(zhǎng)，成本高，某些反應(yīng)會(huì)給動(dòng)物造成極大的痛苦，存在一定的倫理問(wèn)題，且結(jié)果外推存在差異[1，9]。而3T3中性紅光毒試驗(yàn)（3T3 NRU Test）作為動(dòng)物皮膚光毒性試驗(yàn)的一種體外替代方法，已通過(guò)歐洲的歐洲體外

3、替代試驗(yàn)有效性驗(yàn)證中心（ECVAM）驗(yàn)證并收錄進(jìn)OECD化學(xué)物質(zhì)毒性試驗(yàn)指南[10]，具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，重現(xiàn)性好，試驗(yàn)周期短，且與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性好等特點(diǎn)，該方法目前已廣泛應(yīng)用于化妝品、新藥、化學(xué)品的光安全性評(píng)價(jià)[1]。本綜述目的是對(duì)3T3細(xì)胞中性紅攝取光毒性試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展做歸納。一、 一、3T3 3T3細(xì)胞中性紅攝取光毒性實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞中性紅攝取光毒性實(shí)驗(yàn)方法1. 1.實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理許多類型化學(xué)物質(zhì)可以引起光毒性反

4、應(yīng)，其簡(jiǎn)單的特征為能夠吸收陽(yáng)光中的能量。根據(jù)光化學(xué)和光反應(yīng)的第一定律，要求能夠充分地吸收光量子。因此，在進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，必須確定化學(xué)物質(zhì)的紫外線吸收光譜。如果這種物質(zhì)的摩爾消光系數(shù)/吸收系數(shù)小于10L/mol·cm，那么這種物質(zhì)則沒(méi)有潛在的光反應(yīng)，同樣不必進(jìn)行體外3T3光毒性實(shí)驗(yàn)，以及其他光化學(xué)毒性反應(yīng)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。正常狀態(tài)下，細(xì)胞能夠吸收生物活性染料（如中性紅），當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，吸收生物活性染料的能力降低；細(xì)胞膜受到傷

5、害后，吸收的生物活性染料很容易泄露等。因此，體外3T3細(xì)胞光毒性實(shí)驗(yàn)是根據(jù)比較化學(xué)物質(zhì)的光化學(xué)細(xì)胞毒性而進(jìn)行的，即細(xì)胞暴露和非暴露于無(wú)細(xì)胞毒性劑量下紫外線（UVA）或光線，驗(yàn)證待測(cè)化學(xué)物質(zhì)是否具有光毒性。在該實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞毒性表現(xiàn)為，細(xì)胞吸收生物活性染料中性紅的能力降低。2. 2.實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料2.1 細(xì)胞：小鼠成纖維細(xì)胞系-----Balb/c3T32.2 培養(yǎng)基：3T3細(xì)胞用培養(yǎng)基為DMED，添加10%新生牛血清和4mM谷氨酸鹽。

6、2.3 待測(cè)化學(xué)物質(zhì)準(zhǔn)備：待測(cè)物質(zhì)必須新鮮配制，光穩(wěn)定性較差的物質(zhì)應(yīng)在紅光下進(jìn)行操作。2.4 紫外線光源：UVA燈2.5 其他：四甲基偶氮唑鹽（MTT）、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀等。3. 3.實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法體外3T3 細(xì)胞中性紅光毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果（PIF ≥5 或 MPE ≥0.1），表明待測(cè)物質(zhì)具有光毒性。如果結(jié)果是在低于10μg/ml 濃度時(shí)獲得，該物質(zhì)在其他實(shí)驗(yàn)條件下（如體內(nèi)實(shí)驗(yàn)）也可以表現(xiàn)出具光毒性；如果結(jié)果

7、只是在高濃度 100μg/ml 時(shí)獲得，則需要進(jìn)一步研究，以判斷物質(zhì)的危害和潛在的光毒性，包括經(jīng)皮滲透吸收，以及物質(zhì)在皮膚中的累積，可采用其他實(shí)驗(yàn)方法如體外皮膚實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究。體外3T3細(xì)胞中性紅光毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)陰性結(jié)果（PIF 10 的化學(xué)物為有光毒性。盡管如此，有歐洲的權(quán)威組織（EMA）已經(jīng)接受，將這個(gè)分子消光系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)提高到1000。對(duì)于某些樣品（如甲醇），測(cè)定其MEC的標(biāo)準(zhǔn)必須精確肯定，。限制在光照底下的待測(cè)樣品最高濃度在